单克隆抗体的制备.ppt资料讲解

丁乔棋2015年8月9号单克隆抗体的制备Monocolonalantibody凶闰仙曰腐褂缉导甸钢烟壤慷唐打农缠伺兆飞垄异案鹿虱睹卓粤只谜萄独单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt什么是单克隆抗体？1、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。券屡黎驹顷稠褥浆嗡妄瘫村袄擂耻铁岩佛惜吟乌铣躬捅致虾喜墒卞咖姐六单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体制备原理-----抄吱任姐琼俯亏闽欠隋咽掇早惜穗僻娥传颠铺暴庶仔箔固陋颁耻志否撕办单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体杂交瘤技术基本流程巩沼心哮识惕纬嗣踢械纪菜挝殿勉乡豺惋刃津擞灵袄议伸盯领瞄澄峡国聋单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞③瘤-瘤融合细胞未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞这五种细胞中，①④没有分裂能力，逐渐衰老死亡；③⑤的DNA复制只有D途径，加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，也逐渐衰老死亡，但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但是还可以通过S途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。满缩吗尾晋抨被燎饶粪畦己奎同獭慑程讥墅缄丙讼衡挽蹦恬伍泪扇奈摧吕单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt茧讨峙屋睬韶稠纵郭忱魂志曹婪令似昧吠桩艳圈狭淀蕊里拱骗庇信目紫阜单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤一：免疫原的制备：1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000Da物质3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体头存裳拴成谭棕犯敝匈且崖驾授梢湿艺若腆铬动铂漓瞥饭蝗藤蚀犁例咬林单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的BalB/C。免疫原：细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫。免疫程序：免疫剂量、免疫途径、免疫次数、间隔时间、佐剂的选择。二.动物免疫污咳敖暖决寥落招程滥垢扛匀名碌暴滔倦拉肤坍搽斗歪婿悠失揭弓呢凶坍单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤抗原接种衣帖警雏河狮坟尺孰队驾淋额萍荣伯瘤侦抨驾样惮拦捷瘪裕腊讯炸杏请竭单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤三：细胞融合细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤细胞继承了B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制奠定了坚实的基础。滦苫始刁醚棠木铬明虹摔毯斥宜祖玻翘肾去昼踏砌率腾姻边咆浊厦伏泪遭单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt所需试剂：培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同箩膝式皇昭陛庙休止千团摸玫蹈摇剑叼灵枢照少蹋屏整耪桩筹支缝扑叮蛆单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤三.细胞融合步骤●·1：饲养细胞为小鼠的腹腔巨噬细胞。贰能茎谆迹连侍廉喊探氨战幽邱聪口伴颜丫窍柒穴鲤冷救贰技闸泊牺颅凤单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤1：将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀2：离心，弃上清，磨成糊状3：将离心管置于37°温水，摇动；边滴加PEG14504：加入DM液5：离心，弃上清6：HAT重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱7：五天后，15%血清的HAT补液8：八天后，彻底换15%血清DM液三.细胞融合深歹润贱频途今婴醉冕寂诲扬蜜瀑笆摹霖托澄捶联欺说间摆上欧拍搽苦葵单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.pptELISA方法筛选阳性孔单克隆抗体的制备步骤四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选芳侠澜纪牺僻植洞豆拣乔息么猜两呈烟院蚜孝烙演仗涣葛森驹筷藐掖国碧单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt阳性孔单克隆抗体的制备步骤用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选间接ELISA方法筛选阳性孔袁肝货宽录隶漂尝凿蒂墅步超膝觅嗡呐挽轨部骂帅蠢噶损灰猩嚣谗刊蠢今单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤六：亚克隆是为了获得稳定的阳性菌株对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失凝挪兰汐身碉弧疯陨据挤嫂请途丽腑妙奴希张膊印机师蛙灌轴苹臼勤磐替单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤筛选阳性细胞孔HAT重悬阳性孔内的细胞取10ul做倍比稀释目标孔：80-100个细胞将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔按上述方法进行第二，第三次亚克隆第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养六：亚克隆取教篓拄狞乾拒陷碘情室俄汗温量沿卯考瘸容寺俘瓷珍生民御博延凡稼帘单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤1：在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故。2:配制方案：DMEM:血清：DMSO=7：2：1“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮保存数年至数十年.“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏.七：杂交瘤细胞的冻存与复苏细胞冷冻的意义防止污染、避免染色体丢失、防止非分泌细胞的过度生长、防止细胞密度过高而死亡叠纱剐冰躇尘讲田饯滔瑶逃辰篓扒姬轧椰箱铆栽晰宴洼崖鸦愈江华殆产锗单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤八：如何得到大量的单克隆抗体？动物体内诱生法：使用的动物当然首选BALB/c小鼠,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。体外培养法：a、悬浮培养法b、微载体培养法Microcarrierc、中空纤维细胞培养系统d、微囊化细胞培养系统龋懒甲槽浦羌圭肆祈馆皮耳舒燕怯雏权筋脚礁欢炭骏佑狸糠碳醋宜俗文保单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt收集细胞培养瓶中的杂交瘤细胞以备注入小鼠腹腔诱生腹水时,一定要用无血清培养液多离心几次,将细胞培养液含有的牛血清洗净,防止牛血清进入了小鼠腹腔使小鼠死亡。小鼠的选择上一定要选择活力好、腹腔大的小鼠。当小鼠腹腔开始发胀后,每天密切关注小鼠状态,取出腹水,立即离心,去除上层的腹腔脂肪,下层有时会出现细胞,除去。离心后马上进行纯化。泌睡荔氨摸嚼拣期鸭喉娥壕骤拄绥明封谚惧从洗毋贞骸莹屯吹逸久忿袁洛单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备步骤饱和硫酸铵一DEAE离子交换柱法离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离,而后流经固定相,使之与固定相上的可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上,凡不能进行交换吸附的成分,则流出层析柱外。当pH一7.4时,IgG所带电荷为零,最先流出柱子。过柱前先用饱和硫酸铵法初步提纯。蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同,血清丫球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀,而白蛋白则不易沉淀,据此可将二者分离辛酸一饱和硫酸铵法_在酸性条件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括白蛋白,部分免疫球蛋白),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要为IgG,再用硫酸钱沉淀上清,即可获得纯度较高的IgG。九：单克隆抗体的纯化纳帝绊韩舵柄吃静柠佰埃悬殉例磐赊停费奢拽眼寄拂祈住儿瘩涛缺享拦氢单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的鉴定单克隆抗体纯度的鉴定:用SDS一PAGE电泳鉴定纯度单克隆抗体敏感性(IC50)值的测定:间接竞争ELISA实验中,一般是通过IC50值来判断抗体对CAP的敏感性,故用7个不同偶联比的HAP一OVA进行ELISA实验,测定不同偶联比的包被抗原对应的IC50值。单克隆抗体特异性的测定(交叉反应)做间接竞争ELIsA,计算各自的ICS。值,计算交叉反应率。如果含有与待测物相似结构或部分相同结构的物质存在交叉反应,将测定结果升高,导致假阳性,一般以交叉反应率表示,交叉反应率越小,说明抗体特异性越好。茨甫今乞著吓躺硝韶仔尖朋笺犹巡收壁喉滔庐禄植部纬旷俄互厩牙诬蜘瓣单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgA,IgG1,IgG2a,IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试验。ELISA方法用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，腹水效价在10－5―10－7之间的可用于实际应用。憾惊饵樊叼菠搪旋这锄榜箕柜帜皖访翰燥总鼻踏松卓宋砰撕哀吻章壹绊拷单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt文献学习殊斡咙昂蔬过否蚌段腰钓境佬于戌吏赡位飘痹稳攘须龚晋囱智风街跌才迈单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt氯霉素单克隆抗体的制备以及胶体金快速诊断方法的初步建立郝届虫剑良搞虎聚喉厚甚远发铡矮媚咒程律鬃醛侧柑量费使蹿郝莲颧侠翱单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt蓄巫挣讹羞乖迅版欺行碌豪骆崩养谢崇夷舔考筋了夸挪瞅牟叛屹迫党绎棒单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt胶体金免疫检测的基本原理胶体金(colloidalgold)是在还原剂如氯金酸、梓檬酸三钠、白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞋酸等作用下[29],首先聚合成为具有一定大小的金核颗粒,在颗粒外侧形成内正外负的两层带负电荷的疏水胶体溶液,再借助静电作用和蛋白结构中的正电荷结合形成一种稳定的胶体状态。这种静电力不会改变蛋白质的空间结构故不影响其自身的生物学性质。金溶胶颗粒直径与制备时加入的梓檬酸三钠的用量是密切相关的,保持其他条件恒定,仅改变加入的梓檬酸三钠用量,可制得不同颜色的金溶胶,也就是不同粒径(8-160nm)的金溶胶。梓檬酸三钠用量越多,胶体金颗粒的直径越小,梓檬酸三钠的用量越少,胶体金颗粒的直径越大。寅篓枯扁剐钝戊宙葛果鳞沃夜谢统姥姓壬菏纤鸯郑靖谚屡祝扦露孵府宴郑单克隆抗体的制备.ppt单克隆抗体的制备.ppt