微生物环境监控异常调查-上海讲义

微生物环境监控异常调查吴国平[e-mail]1培训时间–9:00～12:00•10:30左右茶歇10分钟–13:30～16:30暂定•15:00左右茶歇10分钟2微生物环境监控异常调查内容•环境污染的过程•警戒限度、纠偏限度的设置•环境监控的偏差处理•趋势分析•微生物鉴定3•多少人曾经现场取过样、分析过环境监控样品？–重复的、枯燥的取样和测试–没有成就感•开放的头脑、站在更高的角度看待环境监控4环境监控的来由医药行业的质量要求•医药行业的高要求：–质量Quality–安全Safety–疗效Efficacy•建立合适的环境监控体系是达到医药行业质量高要求的有效保障5环境监控目的1•目的：建立环境监控程序，是为了确认洁净区域的环境，是否达到了药品生产的要求。以确保最终产品的的生物、理化特性都不会受到环境的影响•同时，还可以说明过程控制、清洁消毒程序是否有效，人员操作是否适当6环境监控目的2•合适的环境监控程序应能做到，区分正常原因造成的环境变化，与非正常原因造成环境变化。–e.g.人员进出洁净区域，因开门关门造成压差变化•因为非正常原因造成的环境变化，往往源自于机械故障和人员活动造成的污染–环境监控结果的分析和偏差调查至关重要7环境监控流程的建立1•建立环境监控流程，包括很多方面，例如:–监控频率(每日、每周、月度、季度)–采样类型、方式(浮游菌、表面样/RODAC、棉签法)–采样位置–警戒限度和纠偏限度–超警戒限度和超纠偏限度的应对流程–人员培训8环境监控流程的建立2•一般情况下，洁净区域所需要进行的环境监控主要包括:–悬浮粒子测试–沉降菌(定性检测)–浮游菌(定量检测)–表面微生物–温度和湿度(房间)–房间或者区域间的压差–风速(层流台、生物安全柜)9环境监控质量风险评估•设计、建立和优化环境监控流程，应充分考虑质量风险评估的原则风险系数=严重性*发生的可能性*被检出的可能性高：192～1000中：72～160低：8～6410D级C级C级LFHA级环境监控案例1微生物限度检测洁净室11•洁净级别和质量风险评估S1S2S3S4高中低环境监控案例1微生物限度检测洁净室12•监控频率(除悬浮粒子)：–S1：每次操作–S2：每使用日一次–S3：每周一次–S4：每周一次C级D级C级LFHA级•监控频率(悬浮粒子)：–S1、S2：每月一次–S3、S4：每季度一次环境监控案例1微生物限度检测洁净室13•取样方法、培养基选择：–沉降菌：90mmTSA平板–浮游菌：90mmTSA平板–表面样：55mmTSAWLP平板(接触碟法)C级D级C级LFHA级环境监控案例1微生物限度检测洁净室14•培养温度和时间：–30～35℃,48～72小时+20～25℃,5～7天C级D级C级LFHA级环境监控洁净区域的设置•设计、建立和优化环境监控流程，应考虑到具体的洁净区域的设置–无菌制剂生产区域(非抑菌性产品、抑菌性产品)–生物制剂生产区域–非无菌制剂生产区域–原料药API生产区域–品控检验区域15C级B级环境监控案例2无菌生产洁净室(头孢类制剂)16灌装线A级•洁净级别和质量风险评估S5S1S3S4S2环境监控案例2无菌生产洁净室(头孢类制剂)17C级B级灌装线A级•监控频率(除悬浮粒子)：–S1/S2/S3/S4：每班次一次–S5：每工作日一次•监控频率(悬浮粒子)：–连续监控/每班次一次环境监控案例2无菌生产洁净室(头孢类制剂)18C级B级灌装线A级•取样方法、培养基选择：–沉降菌：90mmTSA+酶平板(3层无菌包装)–浮游菌：90mmTSA+酶平板(3层无菌包装)–表面样：55mmTSAWLP+酶平板(接触碟法)90mmTSAWLP+酶平板(棉签法)环境监控案例2无菌生产洁净室(头孢类制剂)19C级B级灌装线A级•培养温度和时间：–30～35℃,48小时+20～25℃,5天•缩短对生产的影响，及早了解生产洁净区域情况环境监控其他基本要求1•取样方法、取样位置的选择、监控频率、培养基的选择、培养温度和时间、对偏差的处理方式，应有书面的文件记录•所有的监控数据和记录，都应保存，以便报告和趋势分析20环境监控其他基本要求2•环境监控用的设备都应：–确认(Qualification)–校准(Calibration)–定期清洁/维护–偏差管理•e.g.培养箱温度偏差的处理流程21环境监控其他基本要求3•每批用于环境监控的培养基都应使用前通过促生长测试•每一个样品都需要标记以便识别•采样后，所有的琼脂培养基平板样品，都需要倒置培养–避免的菌落铺满整个平板，无法计数–减少因为长时间培养，水分挥发，琼脂层变薄影响计数结果和菌落形态–防止应在盖子上冷凝的水蒸气回流至培养基表面，造成可能的污染22环境监控其他基本要求4•常规监测应在正常工作(动态/操作中)的情况下进行•当不处于生产状态下，即无GMP活动发生时，不需要进行环境监控–车间停产–HAVC系统维护中23环境监控其他基本要求5•取样者应有合适的着装和防护措施，避免影响采样结果，同时避免对生产环境和过程的不利影响–e.g.取样点的设置•所有进行环境监控的人员，需要经过培训并获得相应资质，而且需要定期重新评估以确保正确的操作24环境监控小结•一个良好的环境监控体系–可执行•生产/IPC/QC/QA–具有说服力•内部人员/外部审计–结果有价值251.环境污染的过程和控制环境污染定义•污染的定义–因为环境、人员控制的原因，造成不属于产品本身的物质被带入到产品中，从而影响了产品的纯度或者造成产品不再适用•污染包括–宏观的污染（玻璃，金属，塑料碎片）–微观的污染（微生物、尘埃微粒和过敏物质）27环境污染为什么要避免污染•污染导致产品不合格，可能会引起无法预料的后果•从顾客角度考虑，污染就意味着–降低产品的功效–加重病人的病情或致病人死亡•从公司角度考虑，污染就意味着–一种低质量的产品–顾客忠诚度下降–召回–一次严重的召回可能拖垮一家公司(雪印、J&J)28过程厂房公用设施设备人员文件规程原料产品环境控制参数29污染•在生产操作中，多种原因会造成对过程和产品的污染•在药品、化妆品、食品等行业，环境污染往往是源自于空气中和各种表面上的微粒，包括非活性的、活性的30污染污染源和污染因素•厂房：灰尘、细菌、非活性微粒•公用设施：细菌、非活性微粒、碳氢化合物、气溶胶•设备：细菌、非活性微粒、难以清洁的位置•过程：非无菌的接触面、利于微生物生长的条件、气溶胶、金属碎片、纤维、玻璃和橡胶颗粒•人：活性的和非活性的微粒(皮肤细胞、细菌)31污染的过程•厂房–空气中的污染会附着在表面–没有适当清洁的地面和工作面–来自建筑材料中的微粒•e.g.被拖车撞坏的墙角32污染的过程•公用设施(水、蒸汽、压缩空气、HVAC)–产生的污染会附着于工作面或者部件的表面–HVAC系统直接影响空气质量、空气流向、压差、温度以及湿度–HVAC:加热Heat、通风Ventilation、空调设施Air-Conditionsystem33污染的过程•生产设备–运转会产生微粒–设备中难以清洁的位置，会成为生产过程中的一个污染源•e.g.设计不合理的U形管路34污染的过程•生产过程–粉末、液体的混合或者制粒，会产生气溶胶–灌装时，玻璃容器的震摇，会产生玻璃颗粒–加塞时，胶塞沿着导轨运动，会产生橡胶颗粒–冲切或者内包时，可能会产生铝膜或者纤维35污染的过程•人：洁净区域中最大的污染源–皮肤表面:•每个成年人的皮肤表面积大约2平方米:•皮肤表面分布了大约1x1014个细菌（集中在出汗和油脂性区域）–口腔:•1x1010个微生物/mL唾液•这就是为什么进入洁净区需要穿戴一次性口罩、帽子、手套和洁净服！36污染的过程•人–人员在工作时，会产生、携带和转移微粒–人做动作时，会有微粒从皮肤上脱落，在人感觉过热或者出汗的情况下尤为突出，污染周边的环境–同时，人还可能将环境中其他的污染源，携带至关键的生产过程甚至产品中37洁净室常见的微生物污染和来源•Staphylococcus葡萄球菌属，人(皮肤，黏膜)•Streptococcus链球菌属，人•Pseudomonas假单胞菌属，水/包装材料•Corynebacterium棒状杆菌属，人(皮肤，黏膜)•Bacillus芽孢杆菌属，土壤/水•Coliforms大肠杆菌属，人•Micrococcus微球菌属，人38环境污染的控制•微生物的数量可以用下列方法降低或控制–灭菌(高压蒸汽、辐照、气态过氧化氢)–消毒(洗手、IPA)–减少粒子产生和散发(洁净服、不戴首饰、身体状态)–降低微生物生长的可能性(控制湿度、去除食物)39环境污染的控制•要达到洁净区域有效环境控制，要求：–合理的洁净区域设计和设备选择–合理的操作流程和清洁/消毒/维护/监控流程–人员对SOP的严格执行402.警戒限度、纠偏限度的设置警戒限度和纠偏限度•定义：(药品生产质量管理规范2010)–警戒限度：当系统的关键参数超出正常工作范围、但未达到纠偏限度，有可能需要采取纠正措施的限度标准42–纠偏限度：当系统关键参数超出可接受标准时，需要进行调查并采取纠正措施的限度标准警戒限度和纠偏限度•GMP2010附录1：应当制定适当的悬浮粒子和微生物监测警戒限度和纠偏限度。操作规程中应当详细说明结果超标时需采取的纠偏措施•通过对比和评估环境监控的数据，建立相应的环境监控的限度43警戒限度和纠偏限度的设置•目的–用以帮助监控和趋势分析，起到警告和控制的作用•需要根据区域、级别的不同，而设置不同的警戒限度和纠偏限度44警戒限度和纠偏限度的设置•警戒限度和纠偏限度的设置常用的方法有：–平均值与标准偏差–百分比–质量控制图45平均值与标准偏差•是用于环境监控数据分析的传统方法•基于假设：样本符合正态分布•警戒限度：平均值+2*标准偏差•纠偏限度：平均值+3*标准偏差46平均值与标准偏差正态分布负指数分布泊松分布47平均值与标准偏差案例3•警戒限度=0.71+2*0.84=2.40•纠偏限度=0.71+3*0.84=3.20•例：表面样(cfu/25cm2)样本数量平均值中位数标准偏差最小值最大值1000.7110.840348平均值与标准偏差案例3•没有任何结果超纠偏限度•实际上从结果从0到1，已经表现出了对正常情况的偏离00.511.522.533.5050100纠偏限度=3.20警戒限度=2.4049平均值与标准偏差•因为大量这种偏离于正常情况的结果，出现在了警戒限度以下，如果没有足够重视，从长期来说，就会导致对过程失去控制优点缺点原理简单假设样本服从正态分布方便使用对非正态分布的过程，会造成错误的判断基于历史数据没有提供数据趋势分析的方法有很多相应的表格可以使用50百分比•对数据不需要进行假设•可以使用于服从正态分布或者非正态分布的样本•将样本数据，从大到小，降序排列51百分比•k=n–(p*n)–k：样本序列号；p：百分比；n：样品数量•找到k样本序列号对应的结果，作为限度值•警戒限度=n–(0.95*n)•纠偏限度=n-(0.99*n)52百分比案例4•例：表面样(cfu/25m2)，样本数量：100个•警戒限度=100–(0.95*100)=5•纠偏限度=100-(0.99*100)=153百分比案例4•纠偏限度：19cfu/25m2警戒限度：16cfu/25m2排名结果119218218417516…………161354百分比优点缺点不需要对样本的分布进行假设对实际过程的限度，可能会造成错误的判断原理简单方便使用如果样本集中在少数几个数值，则无法有效决定限度基于历史数据没有提供数据趋势分析的方法有很多相应的表格可以使用55控制图•控制图使用过程的数据，计算过程的平均值和控制限度•控制图中的限度，较为真实地反映了过程的状态，并且通过回顾那些超过限度的样本，分析者可以容易地分辨出那些需要进一步调查的偏差56控制图•横坐标为时间，纵坐标为样本的结果•控制图中，还可以包括警戒限度和纠偏限度•对环境监控而言，控制图中的控制下限固定为0，所以没有必要在