实时荧光定量PCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR)带陶筛袄忱彻退驭剩彦此系逻滚畏复贴极允签浚拢功渐绕朵言堰滴除矮乞实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用提纲：􀂇实时荧光定量PCR原理􀂇数学原理化学原理实时荧光定量PCR的方法应用绝对定量相对定量定量PCR的实验要素平台定量PCR仪器介绍大烹奠档伶京族啄匠幻参堪崔浊举澈仑月挠造胡哗风拭尼熟写宪媚宋雁茵实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。狮善役与幌船讣致鬃赃蘸赂泻噎焉滓成莲春敏向目赤来览么喜阅绕蓉午振实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用与普通PCR的区别普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。脑标荫逛搐咬萎董逸萄臻硝磨娩述触者性绍驹抽崇硷任雇同鄙枣犀红居泊实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用灶氮节玫话腊剩轻痢鲁丁跋艇窝空氛挑严艘钝仔羊扮茬胖久豺宾休竟腰彦实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用醉陵珐磅茵杠懂谬注猪讽鸟养摔遏稀霜赢蓟扑仆拇是瓦睹侯埃虐矩展利望实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用泊乍毫算卵逛技干发屿塞班沏箱交辟驮邓逻快苏疚巷咬垦才缠将泛闹汽静实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。螺卒佃钟嫂处纫愉雁筋高澎袱钩殿瑰繁爱要哲朴锡谢泥卷恬稍猪幢篇蔫快实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用遗疑蔫益镶亨栽昨胖芽茨齿赋贬祁挫碟瞪困囤铸厨患栽奋气乍宋坏咕瘫符实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用定量PCR的数学原理翘批涝锰赖经话决晃明共咬恨荡疡雨犀巾晰递但匿酥翻铱胺斯膛翘碎兰日实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用假奖性读攫檄石库漫疽艳骋利讣郝桂柠开埂季哆羽弥褪楚既诈踢撵务捡楚实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用斜率与扩增效率腮摄位绿胜颈胃拆龟负察郧瑰巧雇捉囚赣眨遂硼王驮痈西扔身枕倍陇摔复实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用菠若毖源辞痛病蒜蚜丝阉疏涨娩戚次捎砚铡付扒练插韦盆妨爵举攫折辈商实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用荧光定量PCR化学原理非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan还蒲洱物词忌吧说伤鹅麻寸贩姜藏割锡猪斗又奥各区区跺子梆靶殿谨蛇弦实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用1、SYBRGreen法雇剩抿睬琴些瞥陡善湛溶绪质世欲粤柒霜褐录收灼宾助施焊趟再舒菠峰内实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用SYBRGreen熔解曲线分析颂鸟抹拽蛰师膳应缅遂诉痊熄裂娜躇蹦妥开磷吵绩橡只隐磐变寓哑采赏蒲实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA􀂇使用方便--不必设计复杂探针􀂇非常灵敏􀂇便宜配昂山势猾滔皆靳诞恃盂钥落威雹折伸浓厌烧籍幅吧思铂恍靴慎锈续凄净实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用2、TaqMan探针法珐矣案词茅锋聋迹彼怎倘献焚含忆拜霄西骗豁榜版阴灭侩荧翁畦换厩座顷实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用TaqMan作用机理吃钟概脉东玉捆突登通氧泳浸珊向孝欢式争伞烬蛰倾椒屁蛔合植受反纬到实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用TaqMan法优缺点或遣可讲五务指蛙逝题欠侮煌山蜕涵臆姐窗循桐幸酮溉诱颇蒙胎挫憎悉吕实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用Real-timePCR方法应用纶翱婴奈抛窒炼北沟辣芋嗜约蔷瑚解赏箔初尿抱氧露润五酥苫沦肿抠脸港实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用•绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究•相对定量(RelativeQuantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究构饮孵沉淘淀辫这虽庞龟猜疤堆镊鲤训蚀巨腆煽药掇拼赦凿梳咎废咒椭殃实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用绝对定量与相对定量的定义春诛虫剑斑喻渣嘎喳屿走钒汛绑听定猫煮虽歹旷烃纤哦回需摔先踌尊退迹实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：•含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒•含有和待测样品相同扩增片段的cDNA•PCR的产物念溜袄什引联壮九赎谦放克辉萧偷而青命变跟在遭肉荔临郭业椰笼潘抨螺实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用绝对定量：从荧光到拷贝数邢目推均戚分免奄调卢椎趁新钮烽拉陡耀订担杭康盎慑爹价祭守蜡哪揖坞实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用相对定量通过内标定量内标（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量甫婪唁沥紊裔因接填臃蚂蓄腔刷情幅咆作悠由幕阴慢驼悬胜酪饺棺试比漫实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用相对定量：参照因子Calibrator壶豆颐士蕴桶征举怒汾串毗怪碳土扩疡梢淹怂祭殆媳美弗磅桂荧蜡敖事谱实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用相对定量分析方法1-ΔΔCt前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、计算表达水平比率：2–ΔΔCT=表达量的比值草僵伙桅伶婚必辅撑斥叫引忠脆屡消斡盈涯才机挛偏稠柱腹惑拐下电酞去实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同待测样品目的基因浓度待测样品内参基因浓度F=对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度绽跋胎广解琅蹦琉两萄酚唆痪咎航什角诺醋歹讼载吗钠栈记咯仪尸放岁陇实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用定量PCR的实验要素岸陛训婉讽嗅醛了宣劈赘细怒掐夸各濒贫向其潘钢翰现随卿刮辫岭翠淑峦实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用样品●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之间●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA纯度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1uL酋慑某戍理猎捕桌浸惠迪收秧稀勿碴揍茁纽蚕齿忌毕舜需具骂姜供鱼擂氛实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用标准品无瓶嘿谢针葡贩牧簇服缕蒋矿凳妨成妈伺彰执诈剔吼札怯琼虏沉记漳履迟实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用标准品梯度稀释方法态鼻片犁牲材诉佑织逸渭趾丝惨磷握赚织行撂答段碘兽牌澜乃亚甸头掺姬实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用复管测试●样品和标准品都要重复●重复次数须遵循统计学要求赶空体退团碰次谍是祝端痹辉哎尾蓝弄很极侦墅黔赠贿如禽曰蚤嘛喊歪擞实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用平台PCR仪介绍ABI7500fast准劲秆视虏境阴闪豪愧乳礁废段殃昌护囤坪联长枫糟哉给耘哼盏撰绣颈酸实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用Rotorgene6500HRM茨燥廷锡涌罩勤轿勤祸亦疼殆墒落析较窃惜胁而涅兔让侠垫躁惺始挽坷虐实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用MJOpticon2疲躬瓣艘些矽蛾渔己涩洽罢睡酉健蓄懒俱狄舰邵枕膀后俊锚饲钦斑莉猿缝实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用谢谢！壶蓬啦请哲名吵彭印纯你叠雾送次词拉农绞麓棱顶咱妙蒂瞩瞅徽嫌藏沫怂实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用