毒理学基础(全套课件250P)

毒理学基础1.1基本概念急性毒性（acutetoxicity）是指机体一次接触或在24小时内多次接触外来化学物后所引起的快速剧烈的中毒效应（结构与功能变化）。一次接触因给予途径不同定义不同：口服和注射指瞬间将受试物给予机体；吸入和皮肤接触指在特定期间内（24小时）机体持续接触受试物。1.2急性毒性试验的目的确定受试物使一种或几种实验动物死亡的剂量水平（LD50，LD100，LD01），以初步估计该化合物对人类毒害的危险性。为进一步的蓄积毒性试验、亚慢性与慢性毒性试验及特殊毒性试验提供剂量和判断指标的依据。阐明一种化合物的相对毒性、作用方式和特殊毒性表现，找出量-效关系，以便其毒性包括临床症状、生理生化和病理变化、毒性性质和可能的靶器官等有初步了解。为毒理学机制研究的初步探索。确定机体在环境中接触的受试物侵入机体的途径，研究受试物的代谢动力学过程。研究受试物急性中毒的预防和急救治疗措施。1.3急性毒性试验设计1.3.1试验动物的选择1.3.2动物分组及样本例数1.3.3动物喂养环境1.3.4剂量选择1.3.5染毒途径1.3.6试验周期1.3.7观察指标1.3.1试验动物的选择原则是所选动物应使试验的结果能反映或预测人体接触时的反应。要求动物健康，体重差异不超过10%，试验前应禁食16小时。同时尽量选用饲养管理方便、成本低的动物。1.3.1.1动物种属选择1.3.1.2动物品系选择1.3.1.3动物性别选择1.3.1.4动物年龄与体重选择1.3.1.1动物种属选择啮齿类动物猫和犬猪和灵长目啮齿类动物因缺乏呕吐反射而利于经口接触受试物的吸收，但不适于研究经口能引起呕吐的化学毒物的毒性。大鼠和小鼠繁殖力强、寿命短、食谱与人类似、便于分析比较明确的生物学指标，且价格低、易管理。大鼠在代谢和毒性反应上与人类较为接近，用于急性毒性试验占第一位。小鼠占第二位。家兔因盲肠较长，经口接触毒物在肠道的吸收充分，结果往往毒性大于其他动物。猫和犬因试验成本较高，不适于样本量大的试验如测定LD50。仅仅用来验证对毒性或对受试物的毒效应做深入研究时以及对某些毒作用的种属敏感性进行比较。猫和犬有高度发达的呕吐反射系统，有催吐效应的化合物在经口接触时应注意。猪和灵长目猪的食谱及皮肤结构与人接近，是一种用来估计外来化合物对人急性毒性危害水平较好的试验动物。但其饲养管理不便，价贵，也不适于样本量大的试验。灵长目动物在种系上与人类最接近，结果最能反映人体的反应。但其价格昂贵，获得较难。基本不用于急毒试验。1.3.1.2动物品系选择动物品系是指源于一个共同祖先而具有特定基因型的一群生物。不同品系的同种动物，可对同一被检物发生不同反应，即存在品系差异。为了在同种动物中减少这种遗传特性所决定的品系差异，在毒性试验中，最好采用同品系动物，即纯种动物。1.3.1.3动物性别选择性别的选择依试验目的、要求而定。如需要着重观察受试验物对雄性动物生殖功能的影响，应选用雄性动物。如为受试物的致畸形试验作准备，则可只选用雌性动物。如一般地阐明受试物毒性的大小与性质，则应雌雄各半。1.3.1.4动物年龄与体重选择动物年龄一般选用初成年者。最常用的是出生2-3月龄、体重分别为200克和20克左右的大、小鼠；犬则需喂养1年左右；豚鼠体重200-250克；家兔2000-2500克；猫1500-2000克。如需研究受试物急毒作用的年龄差别，则应选用不同年龄组动物。1.3.2动物分组及样本例数试验动物应按年龄、性别和体重进行分层随机分组。随机方法可用抽签法和随机数字表法，即先将动物编号后，进行抽签或查随机数字表。注意随机不等于随意！每组样本例数小鼠10至20只，大鼠12至16只，家兔8至12只。1.3.3动物喂养环境实验动物喂养室室温应控制在22±3℃，家兔可控制在20±3℃，相对湿度30%-70%，无对流风。每笼动物数以不干扰动物个体活动及不影响试验观察为度，必要时单笼喂养。饲养室采用人工昼夜为好，早6点至晚6点进行12小时光照，其余时间黑暗。一般食用常规试验饲料，自由饮水。1.3.4剂量选择一般采用查文献和预试验（少量动物试验），估计LD50的范围。然后以此剂量为中间剂量，然后以4倍数上下各推两个剂量组，共5组，使相邻两对数剂量的差值相等。如P90表6-3。1.3.5染毒途径接触途径的选择应以人在生产生活环境中接触该化合物的方式为出发点。主要有：1.3.5.1经口接触1.3.5.2经呼吸道接触1.3.5.3经皮肤接触1.3.5.1经口接触其是指将受试物经口摄入或用机械直接送入胃的过程。具体包括：灌胃：接触量和时间准确，但操作相对不便。掺入饲料：是将受试物掺入饲料或饮水中，让动物自行摄入的方法，其操作简便，但接触量和时间不够准确。吞咽胶囊：是将受试物装入胶囊内，放入动物舌咽部迫使动物咽下。本法操作不便，仅适于较大的动物。1.3.5.2经呼吸道接触其适于在常温、常压下生产生活中以气态、蒸汽态、气溶胶、烟雾与粉尘状态存在的受试物的急性毒性试验。具体接触方式有：吸入（将试验动物置于含有一定浓度的受试物的染毒柜或其它容器中，让动物自然吸入）和注入（将受试物直接注入试验动物的气管或肺内）。该途径接触的持续时间可依据试验要求而定。毒性大的接触时间可短些，毒性小的可长些。国内一般在求LC50时为2小时。1.3.5.3经皮肤接触液态、粉尘态和气态外来化学物均有接触皮肤的机会。不仅与外露皮肤接触并被吸收，有的还能穿透衣服经皮肤吸收。外来化学物经皮肤吸收是指角质层完整的皮肤，若皮肤破损，化学物经真皮直接吸收，而与静脉吸收的机制相似。1.3.6试验周期急性毒性试验除计算受试物的LD50/LC50外，还需要通过观察实验动物的中毒症状判断受试物的毒作用性质，推断中毒的靶器官等。因此，试验周期一般为2周。1.3.7观察指标应根据急毒试验的目的来确定观察指标。1.3.7.1致死量/浓度1.3.7.2中毒症状1.3.7.3死亡及其时间1.3.7.4体重1.3.7.5其他指标1.3.7.1致死量/浓度常用LD50/LC50。其计算一般采用改良寇氏（kärber）法：LD50=log－1[Xm－i(∑Pi－0.5)]Xm为最大剂量的对数；i为相邻两对数剂量之差的绝对值；∑Pi为各组阳性反应率的总和。毒性较大的用LD5/LC5。毒性剧烈的用LD1/LC1。1.3.7.2中毒症状在急性毒性试验中，动物的中毒症状及死亡一般出现在给予受试物24-48小时内，故观察1周即可。如中毒反应出现较迟，主要在给受试物后48小时-4天，则观察期也应相应延长至2-4周。特别在48-72小时内要仔细观察各剂量组动物的一般反应、临床表现、死前表现及这些反应出现的时间。具体观察指标见P123表6-1。1.3.7.3死亡及其时间观察试验动物接触受试物后的死亡过程有利于探讨其中毒机制或死因。在同系化学物中，有些在致死量下表现出动物先兴奋后抑制，死亡时发生抽搐；而有的则只引起抑制症状，表现精神萎靡、反应迟钝，并在抑制状态下慢慢死亡，表明同系物之间的毒作用有差别。1.3.7.4体重在急毒试验中对于存活动物尤其是低于LD50组的动物，应观察动物体重变化，以便了解受试物引起的中毒效应是短暂的还是较长期的。尽管引起动物体重下降或增长率减慢的原因较为复杂，如受试物影响食欲或消化系统功能而使动物厌食或拒食可使体重下降，受试物可能会引起腹泻而引起食物的吸收利用也可导致体重下降。影响肾功能可使水盐代谢的紊乱而可影响体重。1.3.7.5其他指标根据上述某些指标的阳性结果可进一步扩大观察项目，如测定体温、心电、脑电等生理学指标或某些生化指标，有利于深入探讨受试物的毒作用特征。对死亡动物要取部分组织进行病理解剖学检查，记录各器官系统肉眼可见的病变；停止观察后也应抽取部分存活的动物进行病理解剖学检查。病理解剖学检查对迟发性死亡动物，尤其是发生双峰死亡的现象是必要的。双峰死亡指早期死亡较多，继而减少，然后又出现大批死亡的现象。病理解剖学检查对估计受试物的毒理作用有一定的意义，并可为亚慢性、慢性和其它毒性试验的设计提供依据。1.4急性毒性替代试验1.4.1固体剂量法（fixeddoseprocedure）1.4.2急性毒性分级法（acutetoxicclassmethod）1.4.3上下移动法（阶梯法，up/downmethod）1.4.1固定剂量法与经典方法不同的是它不以动物死亡作为观察终点，可以利用预先选定的或固定的一系列剂量染毒，从而观察化学物的毒性反应来对化学物的毒性进行分级。实践证明可大量节省试验动物。实验选择的剂量范围是5、50、500mg/kg，最高限量是2000mg/kg。欧共体（EEC）的急性经口毒性分级标准是：高毒（LD50＜25mg/kg），有毒（LD50为25-200mg/kg），有害（LD50为200-2000mg/kg），不分级（LD50＞2000mg/kg）4个等级。1.4.2急性毒性分级法它是以死亡为终点的分阶段试验法，每阶段3只动物，根据死亡动物数，平均2-4阶段即可判定急性毒性。使用动物数量少。首选大鼠进行试验，在25、200、2000mg/kg中选择一个剂量开始试验，并据其结果判断：不需进一步试验进行分级；下阶段以相同剂量的另一种性别试验；下阶段以较高或较低的剂量水平进行试验。动物观察14天，在染毒当天观察体征和死亡至少2次，之后每天观察1次。染毒前和每周测体重，所有动物进行大体解剖，必要时进行组织病理学检查（病检）。1.4.3上下移动法它以死亡为终点但也可用于观察不同的终点。特点是所需的动物数更少。根据初步的资料确定第一个动物接受化学物的剂量，由第一只动物染毒后的反应决定第二只动物接受化学物的剂量，如果动物死亡，则下一个剂量降低；如存活则下一个剂量增高。该方法需要选择一个合适的剂量范围，使大部分动物所接受的化学物剂量都在真正的平均致死量左右。1.5LD50应用中的有关问题LD50具有重要的毒理学意义：在药物研究中，评价药物急毒的大小，比较不同药物毒性的大小；计算药物的治疗指数；为后续的重复给药毒理学试验提供剂量参考；比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息；试验中毒量及其体征为临床不良反应监测提供参考。LD50的局限性：评价新药及化学物时提供的信息较少，实用性有限；影响因素多，如性别、年龄、身体状况及环境因素等；物种差异性影响大；经典试验所需的动物数量多。1.6急性毒性评价在生产、运输、贮存和销售使用过程中也需要根据外来化学物的毒性分级，采取相应的防护措施。为评价外来化学物急毒的强弱及对人类的潜在危害程度，国际上提出了化学物急毒的分级标准用以对急毒进行评价。为便于比较化学物的毒性及有毒化学物的管理，国内外根据LD50的大小提出了许多分级标准。WHO公布的《全球化学品统一分类和标签制度》（GHS）中关于急性毒性危险类别和标签的要求见P125表6-2。注意：急毒不大，慢毒可能很大。因此不能将急毒分级与慢毒分级混淆。2局部刺激试验目的在于了解化学物对眼和皮肤的局部刺激性和腐蚀性。2.1眼刺激试验（eyeprimaryirritationtest）2.2皮肤原发性刺激试验（skinprimaryirritationtest）2.3皮肤致敏试验（skinsensitizationtest,allergiccontactdermatitistest）2.1眼刺激试验其观察终点为眼刺激和眼腐蚀。眼刺激（eyeirritation）指眼前表面接触受试物后产生的局部可逆性炎症变化。眼腐蚀（eyecorrosion）指眼前表面接触受试物后产生的局部不可逆性组织损伤。方法用Draize试验：家兔4只，滴眼后观察结膜（红、肿、分泌物）、角膜（混浊度及范围）和虹膜（红、肿）的反应，按规定的分级标准进行评分。一般观察7天，必