纳他霉素的发酵生产、分离提纯及检测-广州大学实验报告

纳他霉素的发酵生产、分离提纯及检测学院：生命科学学院班级：XXX学号：XXX姓名：XXX摘要本实验利用褐黄孢链霉菌进行发酵生产纳他霉素，通过对褐黄孢链霉菌进行孢子和种子液培养以及摇瓶发酵培养，使其产纳他霉素，并分离纯化得到0.35g/L纳他霉素。期间每24h对培养液取样镜检观察菌体生长，并用分光光度计测定OD值。本实验表明，随着培养时间增加，纳他霉素的含量逐渐增加，菌体生长，菌丝变长而紧密。关键词纳他霉素摇瓶发酵褐黄孢链霉菌1前言纳他霉素（Natamycin）是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，也称游链霉素或匹马霉素(Pimaricin)。它是由5个多聚乙酰合成酶基因编码的多酶体系合成。由于它能够专性地抑制酵母菌和霉菌，被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗。纳他霉素是近白色至奶油黄色结晶粉末，几乎无臭无味，溶点280℃（分解），分子式C33H47O13，相对分子量665.75，结构式如图所示。纳他霉素是一类两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5。在大多数食品的pH值范围内，纳他霉素是非常稳定的。高温、紫外线、氧化剂及重金属等会影响纳他霉素低的稳定性。但可以瞬时高温（温度可达100℃）不影响其活性。N-Natamycin(3-N-dimethylaminopropylsuccimido)的活性比较低，可能是对它的化学修饰都会降低其活性，纳他霉素是经深层发酵和多步提取工艺精制而成，其制剂通常是50%纳他霉素和50%乳糖的混合物。纳他霉素的生产菌种主要有Streptomyceschattanovgensis,Streptomycesnatulonso,Streptomycesgilvosporeus等3种链霉菌。本实验所用菌种为褐黄孢链霉菌（Streptomycesgilvosporeus），孢子丝螺旋形。孢子表面带刺。在发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源(葡萄糖)。纳他霉素在以葡萄糖作为碳源时产量最高，这是因为葡萄糖能渗入纳他霉素的分子中去。有资料表明，氮源的类型对菌体生长和纳他霉素的产量有较大影响，菌体细胞生长最好的氮源是酵母抽提物，而纳他霉素产生的最佳氮源是牛肉浸出物。纳他霉素是26种多烯烃大环内酯类抗真菌剂的一种，多烯是一平面大环内酯环状结构（图1），纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华力和真菌细胞质膜上的甾醇分子结合，形成抗生素－甾醇复合物，破坏细胞质膜的渗透性；分子的亲水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔，损伤膜的通透性，从而引起菌内氨基酸、电解质等重要物质渗出而死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些类甾醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用。图1纳他霉素的分子结构2材料与方法2.1材料摇床（HYG-B全温度摇瓶柜）、真空干燥箱（型号：DZX-6090）、显微镜、离心机、生化培养箱、紫外分光光度计、褐黄孢链霉素、酵母提取粉、麦芽提取粉、葡萄糖、蛋白胨、琼脂、氯化钠、大豆分离蛋白、麦芽糊精、酵母提取粉、乙醇、甲醇、20%NaOH、抗氧化剂BHA、1,2丙二醇、纳他霉素标准品、250ml三角瓶等等2.2方法2.2.1培养基制备2.2.1.1斜面孢子培养2.2.1.1.1孢子培养基酵母提取粉4g/L，麦芽提取粉10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂20g/L，pH7.02.2.1.1.2孢子斜面制备按斜面孢子培养基配方称好原料，用融化琼脂溶解，定容，用20%氢氧化钾调pH，121℃灭菌15min，摆斜面冷却后置于37℃培养1-2天，备用。用斜面转管接种，25℃培养10天，待孢子长满后，放置冰箱5天以上再用。涂片观察孢子形态，并显微拍照。2.2.1.2摇瓶种子培养2.2.1.2.1摇瓶种子培养基葡萄糖15g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、pH7.02.2.1.2.2摇瓶种子制备按摇瓶种子培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调pH，分装（250ml装50ml），121℃灭菌15分钟。待培养基冷却后，刮取孢子接种摇瓶，每支斜面接种5瓶摇瓶。，29℃，200rpm振荡培养24小时。无菌取样，涂片观察种子菌球形态，并显微拍照。2.2.1.3摇瓶发酵培养2.2.1.3.1摇瓶发酵培养基大豆分离蛋白19.5g/L、麦芽糊精50g/L、酵母提取粉4g/L、葡萄糖6g/L、pH7.02.2.1.3.2摇瓶发酵按摇瓶发酵培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调pH，分装（250mL装40mL），121℃灭菌25分钟。待培养基冷却后，取摇瓶种子1ml接种，29℃，200rpm振荡培养120－168hr。每隔24hr无菌取样，涂片观察菌球形态，并显微拍照。2.2.2制作标准曲线取50mg的纳他霉素，溶于100mL丙二醇，得浓度为500μg/mL的纳他霉素原液。按表8-1制作曲线，横坐标为纳他霉素工作溶液浓度，纵坐标为OD303nm。注意给出回归方程（y=kx+b）和相关系数（R2），如果相关系数＜0.99，要求重做标准曲线。产物浓度计算公式为：纳他霉素含量（mg/L）=X×100×n其中：X为将所测样品的OD303nm作为y值，代入回归方程中求出的相应的x值。100为样品处理时2次稀释倍数之积。如果所得样品OD303nm超出标准曲线范围为，则稀释n倍后再次测定。表1纳他霉素标准曲线工作表管号123456工作溶液浓度（μg/mL）01.252.53.7556.25纳他霉素原液（mL）添加量00.0250.050.0750.10.125水（mL）109.9759.959.9259.99.8752.2.3纳他霉素的提取与检测纳他霉素不溶于水，因此它在发酵液中呈晶体状。纳他霉素晶体有针型的，圆盘型的等等。它们都是在发酵过程中形成，直径一般在0.5～20nm。从接种后第48h开始，每隔24h从每瓶发酵液中取0.5mL的发酵液，混合均匀，取混合后的发酵液0.5mL，加4.5mL的丙二醇（此过程样品稀释了10倍），在摇床上震荡1小时，12000rpm离心10min，取0.5mL上清液，加4.5ml蒸馏水（此过程样品再次稀释了10倍），摇匀，在紫外分光光度计303nm测定光密度。如果吸光度太大，需要再稀释一次，计算结果时记得乘以此稀释倍数。剩余的混合后的发酵液平批分成2份，分别用于测定还原糖和氨氮。2.2.4纳他霉素的分离纯化2.2.4.1发酵液6000rpm离心10min。离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积。2.2.4.2湿菌泥加2倍体积95%乙醇，20%氢氧化钠调pH10～10.5，边加边搅拌0.5hr（注意一定要调过pH后再计时），以便纳他霉素充分溶解。2.2.4.36000rpm离心10min，保留上清液。2.2.4.4用1N盐酸调pH6.5，静置3hr以上（或冰箱过夜），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出。2.2.4.56000rpm离心10min，保留沉淀（产物）。2.2.4.655℃真空干燥2hr，称重。3．结果与分析3.1发酵过程褐黄孢链霉菌形态的变化图2刮菌镜检10X图为在斜面培养基培养7天，将斜面孢子接种到种子培养基前（种子培养0h）的孢子形态,由图可看出孢子呈圆球状。图3种子培养基培养24h（发酵液培养0h）油镜由上图可知，种子培养基培养24h（发酵液培养0h）时，菌丝十分完整，菌丝比较长，菌体密集，由此推测该菌体生长较旺盛，故可转于发酵培养基中培养。图4发酵液培养24h油镜图5发酵液培养48h10X由图4和图5观察菌落的形态可知，由于转入到发酵培养基中时间不长，可能由于不适应等原因，菌体生长比较缓慢，菌丝不是很长。图6发酵液培养72h油镜图7发酵液培养96h油镜由图6和图7可看出，在发酵培养72h和96h时，在油镜下观察到菌体的菌丝较长且较密集，可以看到圆形的孢子，但视野主要是菌体的菌丝。随着时间的增长，菌丝密度越来越大，菌丝越来越长。图8发酵液培养120h油镜图8为发酵培养120h在油镜下观察的菌体情况，可以看到菌体减少，大量菌丝断裂且有较多圆形孢子，这是因为菌丝已经开始老化，此时，纳他霉素的含量也有所增长。3.2纳他霉素的检测3.2.1纳他霉素的标准曲线表2纳他霉素标准曲线表管号1234567工作溶液浓度（μg/mL）101.252.53.7556.257.5纳他霉素原液（mL）添加量00.0250.050.0750.10.1250.15水（mL）109.9759.959.9259.99.8759.85OD303CK0.0920.1950.310.4010.5010.645图9纳他霉素标准曲线3.2.2纳他霉素的检测表3纳他霉素含量随时间变化表培养时间/h24487296120稀释倍数100100100200200OD值0.2970.5310.6250.4500.556纳他霉素浓度（g/L）0.0740.1300.1530.2220.273y=0.412x-0.0063R²=0.998-0.100.10.20.30.40.50.60.700.020.040.060.080.10.120.140.16OD值溶液浓度ug/mL图10纳他霉素浓度随发酵时间变化图分析：由表3和图10可知，纳他霉素的浓度随发酵时间增加而增加，且接近线性关系。3.3纳他霉素的分离纯化离心前发酵液体积/mL300离心后上清液体积/mL256湿菌泥体积/cm244干菌泥与离心瓶/g40.44瓶子的重量/g40.33纳他霉素干重/g0.11由此分析：1、由120h测得的纳他霉素的浓度为0.273g/L，而本实验中分离纯化得到的纳他霉素的含量为0.110.3=0.35g/L0.273g/L,其中0.35g/L较0.273g/L迟一周测量，因此可推测出，此后一周发酵液培养中，纳他霉素含量有所增长，约0.35-0.273=0.077g/L2、本实验中，本小组在分离纯化过程中，纳他霉素损失十分小，实验非常成功！00.050.10.150.20.250.30.35020406080100120140纳他霉素含量（g/L）发酵时间/h4．讨论在本实验中，我们尝试了通过摇瓶发酵生产纳他霉素，加深了我们对好氧发酵过程中菌体生长与次级代谢产物积累的关系的认识，也积累代谢调控发酵及相关产品分离纯化和分析检测的经验，这些是我们之前都没有接触过的。我们小组的实验中，在发酵液培养期间，我们在培养时间为0h到120h中，每天都用显微镜观察菌体生长情况，随着菌体生长，菌体逐渐老化，孢子的数量也逐渐增多，菌丝开始断裂，代谢产物的含量也越来越大（在本实验中，稍显出指数增长的趋势），让我们更加深刻地了解菌体生产与次级代谢产物积累的关系。在刚开始，虽然我们以前有用过显微镜进行镜检操作，但是很多操作要点都忘记了，因此，老师让我们尝试镜检时，我们很多人都没有成功，后来经过多次的探索。我慢慢摸索到了窍门：1、取菌体的时候要记得打散，不然视野看上去会一片红。2、染色时间不能太长，否则显微镜下看到视野也会看到红色一片。3、盖盖玻片的时候，载玻片应该保持湿润并把盖玻片轻轻地放在载玻片上，否则盖玻片会贴不牢固或者有气泡。4、用酒精灯烘干时间不能太长，否则载玻片会焦等等。另外，在次级代谢产物的分离纯化中，我们小组最终得到了0.35g/L的纳他霉素。据了解和比较，在摇瓶水平下，能达到这个值已经是很不错了，这样好的实验结果有赖于小组每一位成员的严谨的实验态度和相互之间的融洽的配合与合作，更要感谢为我们准备实验用品和一切事项的李老师和循循善诱给我们教导的雷德柱老师！万分感谢！5.思考题5.1种子液菌球与发酵液菌球在形态上有什么区别？为什么会有这种区别？种子液菌球的菌丝较发酵液菌球的菌丝短，其孢子呈圆形，为链状。整个菌球形状比较松散。而发酵液菌球的菌丝比较长，菌球大而紧密。造成这种区别的原因是：种子液与发酵液的营养成分不同，可能是发酵液中的营养成分使其逐渐形成形态上的差异。5.2纳他霉素的分离纯化中需要两次调节pH值，其目