第二章-天然药物化学成分提取分离鉴定方法1

第二章天然药物化学成分提取分离鉴定的方法与技术123鉴定提取分离工业生产科学研究药品化妆品青蒿素白藜芦醇……内容第一节提取方法与技术﹡第二节分离精制方法与技术﹡第三节结构研究方法与技术4第一节提取方法与技术常用的方法有：一、溶剂提取法（最常用）﹡二、水蒸气蒸馏法﹡三、升华法四、超临界流体萃取法提取：选择适宜的溶剂和适当的方法，将所要的成分尽可能完全地从天然药物中提取出来，而杂质尽可能少地被提出的过程。5一、溶剂提取法（一）定义：指根据天然药物中各化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当的方法将所需化学成分尽可能完全从药材组织中溶解提出的方法。在实际工作中应用最普遍67溶剂对药材组织细胞不断作往返的扩散、渗透、溶解，直至药材组织细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达平衡。扩散、渗透、溶解（二）基本原理：“相似相溶”亲脂性的成分易溶于非极性的溶剂中，亲水性的成分易溶于极性的溶剂中。（三）溶剂的极性8石油醚＜苯(C6H6)＜乙醚(Et2O无水)＜氯仿(CHCl3)＜乙酸乙酯(EtOAc)＜正丁醇(n-BuOH)＜丙酮(Me2CO)＜乙醇(EtOH)＜甲醇(MeOH)＜水(H2O)与介电常数ε有关，介电常数越大，极性越大。极性从低到高的顺序依次是：9水极性低高亲脂性有机溶剂亲水性有机溶剂与水分层的有机溶剂?能与水分层的极性最大的有机溶剂?与水可以以任意比例混溶的有机溶剂?极性最大的有机溶剂?极性最小的有机溶剂??1、水：为极性最大的溶剂，适用于提取水溶性成分。如：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、有机酸盐、亲水性色素、无机盐。其中蛋白质不溶于热水。优点：价廉、安全、无毒、对组织穿透力强。缺点：提取液易发霉，蒸发浓缩耗能大，含多糖类原料过滤困难。10常见溶剂的适用范围2、亲水性有机溶剂（丙酮、乙醇、甲醇）：以乙醇最常用。提取范围较广，除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉、部分多糖和油脂等外，大多天然药物化学成分能在乙醇中溶解。优点：对组织细胞穿透力强，提取全面，毒性小，易过滤，不霉变，易浓缩回收。缺点：价高、易燃，需回流设备。113、亲脂性有机溶剂：与水不相混溶的石油醚、苯、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂。用以提取挥发油、苷元、蒽醌类、游离生物碱、黄酮等亲脂性成分。优点：提取专属性强（提出物较纯，杂质少）,易回收浓缩。缺点：价高、易燃、有毒、穿透性差、对设备要求高。12（四）溶剂选择的原则13基本要求：1、对所提取成分的溶解度大，对杂质的溶解度小；2、对目标组分不起化学反应；3、经济易得，低毒安全，使用方便；4、沸点适中，易回收。选择适当的溶剂是提取步骤的关键。主要根据溶剂的极性、被分离成分的性质、共存的其它成分（杂质）的性质三个方面。（五）操作方式1、浸渍法2、渗漉法3、煎煮法4、回流提取法5、连续回流提取法6、超声提取法14根据目标组分的极性、热稳定性、挥发性和溶剂的性质等选用合适的方式。1、浸渍法：将药材用适当的溶剂在常温或温热（40-60℃）的情况下浸泡一定时间，以溶出其中成分。15冷浸法：室温（15-25℃）温浸法：40-60℃多重浸渍法：重复浸提2-3次分类•乙醇(最常用)•水（酸/碱）粉碎好的药材放入提取用的容器中，加入溶剂使没过药面，浸泡。滤出溶剂，加入新的溶剂继续提取（多重浸渍）。加入溶剂浸泡浸泡后浸渍法17本法适用于有效成分遇热易破坏以及含大量淀粉、树胶、果胶、粘液质等多糖药物的药材的提取。优点：操作方便，简单易行。缺点：浸出效率较低，故对贵重、有效成分含量低、需制成高浓度制剂的药材的提取不宜采用；耗时长，溶剂用量大，水提液易发霉。浸渍法2、渗漉法：将药材粉末装在渗漉筒中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉筒下部流出浸出液的一种浸出方法。本法适用于有效成分遇热易破坏的药材及有效成分含量低的药材。优点：提取效率较高，浸出液较澄清。缺点：耗时长，溶剂用量大，操作麻烦。18动态提取良好的浓度差渗漉法连续渗漉装置粉碎浸润装筒排气浸渍渗漉收集提取溶剂粉碎药材棉花或纱布渗漉液3、煎煮法（热提取，只能用水做溶剂）：煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。适用于有效成分能溶于水且不易被水、热破坏的天然药物的提取。优点：简便易行。缺点：提出杂质多；不能用于提取含挥发油成分及遇热不稳定性成分的提取；含多糖类丰富的药材，因煎液粘稠，难以滤过。2021煎煮法“加水煮沸，去渣取汁”药材加水浸泡加热至沸微沸状态一定时间滤取煎液重复1-2次合并煎液4、回流提取法：用低沸点、易挥发的有机溶剂加热提取天然药物中有效成分时，需采用回流提取法以减少溶剂的挥发损失，提高浸出效率。22乙醇、甲醇、三氯甲烷、苯适用于脂溶性较强的天然药物化学成分的提取。23回流提取法•优点：提取效率较高。•缺点：受热时间较长，不能用于热不稳定性成分的提取；且溶剂消耗量仍大，操作较麻烦。?改进5、连续回流提取法：为了弥补回流提取法中需要溶剂量大，操作较烦琐的不足，可采用连续提取法，即用最少量溶剂最大限度地提出有效成分。适用范围：脂溶性化合物。装置：脂肪提取器或称索氏提取器。2425连续回流(索氏提取)•优点：提取效率最高，最节省溶剂。•缺点：回流时间长（4-10h），不能用于热不稳定性成分的提取。6、超声提取法原理：利用超声波的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出与释放；超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散；同时超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。提取速度快、时间短、收率高、无需加热。是一种利用超声波浸提有效成分的方法。26助溶1、溶剂性质2、操作方式（方法）3、药材粉碎度4、温度5、时间6、其他因素27（六）影响提取的因素选择合适的溶剂和操作方式是关键！二、其他提取方法•水蒸气蒸馏法﹡28是将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。道尔顿分压定律：P=P水+P不溶物质P等于外界大气压的时候，混合物沸腾。因此在常压下应用水蒸气蒸馏，能在低于100℃的情况下将高沸点组分与水一起蒸出。29水蒸气发生部分蒸馏部分冷凝部分接收器防止液体倒吸和系统堵塞！进行水蒸气蒸馏的物质必须具备以下三个条件：30该法适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中草药成分的提取。主要用于挥发油的提取。1、不溶或难溶于水；2、共沸下与水不发生化学反应；3、在100℃左右时，必须具有一定的蒸气压。31•升华法有些固体物质受热后会直接汽化，遇冷后又凝固为原来的固体化合物，该现象称之为升华。对于具有升华性质的有效成分，可采用升华法提取。如从樟木中提取樟脑，从茶叶中提取咖啡因。此法简单易行，但在实际提取时很少采用。因为升华所需温度很高，中草药容易炭化，炭化后产生的挥发性的焦油状物，容易黏附在升华物上，不易精制除去；其次，升华不完全，产率低，有时还伴随有分解现象。32•超临界流体萃取法（SFE）利用超临界流体优良的溶解性能对成分进行提取和分离的新技术。特点：流体密度近似液体，粘度与气体相似。扩散力和渗透性优于液体，介电常数随压力增大而增加，有利于溶质的萃取，无溶剂残留。常用作超临界流体的物质：二氧化碳、氧化亚氮、乙烷、乙烯和甲苯等。表1、天然药物提取方法小结提取方法溶剂操作提取效率使用范围备注浸渍法水或有机溶剂不加热效率低各类成分，尤遇热不稳定成分出膏率低，易发霉渗漉法水或有机溶剂不加热—脂溶性成分消耗溶剂量大，费时长煎煮法水直火加热—水溶性成分易挥发、热不稳定不宜用回流提取法有机溶剂水浴加热—脂溶性成分热不稳定不宜用，溶剂量大连续回流提取法有机溶剂水浴加热节省溶剂、效率最高亲脂性较强成分用索氏提取器，时间长水蒸气蒸馏法水水蒸气蒸馏—挥发性成分，与水不相混溶工艺简单，但适用范围较窄升华法无直火/水浴/油浴—升华性成分操作时间长，物质易分解33第二节分离精制方法与技术34天然药物粗提液是多种物质的混合，需要进行进一步的分离和精制。分离精制前需浓缩提取液，减压蒸馏为最常用的方法。“去其糟粕，取其精华”旋转蒸发仪35一、系统溶剂分离法：溶解度差异﹡二、两相溶剂萃取法：分配比差异﹡三、沉淀法：溶解度/酸碱度差异﹡四、结晶与重结晶法：溶解度差异﹡五、透析法：分子大小差异六、分馏法：沸点差异七、色谱法：吸附、分配以及亲和力差异﹡分离依据：共存成分的性质差异寻找差异利用差异一、系统溶剂分离法﹡是一种按极性由小到大的顺序，选用不同极性的溶剂组成溶剂系统，依次分离提取液中各种不同成分，使各溶解度有差异的成分得到分段分离的方法。提取液浸膏/惰性吸附剂……表3、天然药物成分及其较适用的提取分离溶剂天然药物成分的极性天然药物成分的类型适用的提取分离溶剂强亲脂性挥发油、脂肪油、蜡、脂溶性色素、甾醇类、某些苷元石油醚、乙烷亲脂性苷元、生物碱、树脂、醛、酮、醇、醌、有机酸、某些苷类乙醚、氯仿中等极性小某些苷类（如强心苷类）某些苷类（如黄酮苷类）某些苷类（如皂苷、蒽醌苷类）氯仿：乙醇（2：1）乙酸乙酯正丁醇中大亲水性极性很大的苷、糖类、氨基酸、某些生物碱丙酮、乙醇、甲醇强亲水性蛋白质、粘液质、果胶、糖类、氨基酸、无机盐类水3738此法是早年研究天然药物有效成分的一种最重要的方法，主要用于分离提纯含有极性不同的各种化学成分的中药提取液。目前仍是研究不明成分最常用的方法。此法操作繁琐，相同成分可能会散在不同的抽提部位，不易浓集。限制了微量成分、结构性质相似成分的分离纯化。特点适用范围二、两相溶剂萃取法﹡39原理：利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的差异而达到分离的方法。分配系数K=CU/CLCU、CL分别为溶质在上相、下相的平衡浓度。K相差越大,分离效率越高。举例：A、B两种溶质在CHCl3/H2O中进行分配，如A、B均为1克，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比为VCHCl3/VH2O=1，在分液漏斗中作一次振摇分配平衡后，90%以上的溶质A将分配在上相溶剂（水）中，不到10%的A分配到下相溶剂（氯仿）中。同样的道理，溶质B分配将与A相反。分离难易与分离因子β40β≥100时一次简单萃取即可将二者分开;100＞β＞10时，需萃取10~12次;β≤2宜用逆流分溶法;β≈1不能用本法分离。定义：A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值(注：KA＞KB)。分离因子β=KA/KBβ越大,两种溶质越易分离。分配比与pH41对酸性、碱性及两性化合物来说，分配比还受溶剂系统pH的影响。因为pH的变化可以改变它们的存在状态（游离型或解离型），从而影响在溶剂系统中的分配比。一般pH3时，酸性物质多呈非解离状态（HA）、碱性物质则呈解离状态（BH+）存在；但pH12，则酸性物质多呈解离状态（A-）、碱性物质则呈非解离状态（B）存在。?如何利用萃取溶剂的选择42萃取分离必须满足两个条件：（1）两相溶剂必须互不相溶；（2）被分离各成分有不同分配系数。举例：药材水提液中亲脂性成分,可用石油醚、苯、氯仿、乙醚萃取；中等极性成分用乙酸乙酯萃取；亲水性成分可用正丁醇、异戊醇等萃取。1、简单萃取法2、pH梯度萃取法3、逆流连续萃取法4、逆流分溶法两相溶剂萃取常用方法与技术431、简单萃取法:•萃取操作原则：“少量多次”。•操作注意（1）水提液的相对密度应在1.1-1.2之间。（2）防止乳化。44•实验室用分液漏斗;•一般在水和亲脂性有机溶剂中进行。452、pH梯度萃取法：利用不同成分的酸碱性的差异，在某一定pH下，某些成分可以成盐或游离，改变该成分在溶剂系统中的分配系数而与其它成分分离。举例：用pH梯度萃取法的萃取剂分离某有机溶剂中的黄酮类化合物，可依次选用pH由低到高的碱液如5%碳酸氢钠、5%碳酸钠、0.2%氢氧化钠、4%氢氧化钠的水溶液做萃取剂进行萃取，使成盐而达到分离目的。3、逆流连续萃取法原理：利用两相互不相溶的溶剂相对密度的不同，使相对密度小的液相做为移动相，逆流穿过相对密度大的作为固定相的相液，借以交换溶质而达到分离的目的。优点