多靶点pCRISPR载体改良版(单子叶植物用)使用方法2014-10-26(P)副本

1CRISPR/Cas9-basedgenomeeditingtechnologyACRISPR/Cas9vectorsystemformultiplextargetingofgenesitesinmonocotplants亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组（[e-mail]）1.CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图5’NNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTargetSitePAMNNNNNNNNNNNN-3’3’NNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN5’-G/ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAACGAUAGAAAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUCas9nucleaseCleavagesitegenomesequenceRuvC-likedomainHNHdomainCUUGAAAAAGUGGCACCGAGCGUGGCUUUUUU-3’NGG22相关载体图谱2.1CRISPR/gRNAvectors(单子叶植物用)(sgRNA:singleguideRNA,简称gRNA)：注：用载体骨架长片段隔开U3/U6启动子和gRNA区可避免未切断质粒被PCR扩增（短时延伸20秒)见后面）。这些质粒在E.coliDH10B繁殖。2.2CRISPR/Cas9双元载体(单子叶植物用)pYLCRISPR/Cas9-MH，原命名pYLCRISPR/Cas9-MTmono(M=monocot;H=HPT，抗潮霉素基因)pYLCRISPR/Cas9-MB(B=Bar,抗草苷膦基因)本套载体系统的pCas9为本实验室设计合成的植物优化密码子基因。双元载体骨架（LB—RB非T-DNA序列）为pCAMBIA-1300(ACCESSION:AF234296)与以前的载体相比，这2个载体改造了原来的融合型ccdB即LacZ/ccdB为ccdBs(shortenccdB,即删除了LacZ序列)及其相对方向反过来，其它部分不变。pYLgRNA-OsU6a~c;-OsU3BsaI(1)BsaI(2)HindIIIBamHIOsU3,OsU6a,b,cpUC18backboneAmprBsaIgRNApYLgRNA-OsU3/LacZBsaI(1)BsaI(2)HindIIIBamHIU3/6upstreamprimersgRNAdownstreamprimersOsU3pUC18backboneAmprBsaIgRNAE.coliPrLacZagagaccTCTGA----GCGTCggtctcaGTTTBsaI(1)BsaI(2)pUC18backboneOsU6aGGCAOsU3GCCGTranscriptioninitiationsitesOsU6bGTTGOsU6cTCAGRicesmallnuclearRNApromotersBsaIcutting:NNNggtctcNNNNNNN-33-NNNccagagNNNNNNNgRNAtctctggAGACT----CGCAGccagagaCAAALacZMluIgRNAdownstreamprimersU3/6upstreamprimers3注：这些质粒保存在E.coliTOP10F’(LacIq)菌株繁殖，以使ccdB(大肠杆菌致死基因)能够被LacIq产生高水平阻碍蛋白抑制其表达。3.基因组靶位点选择和双链接头设计3.1靶位点选择（1）在目标区如果能够找到NGG上游第20碱基是A（用U3启动子）或G(用U6a~c启动子）的序列(A，G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基），优先选为靶序列GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCTCTGAAG(ccdBs,657bp)GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGGCGCGCCTCTCGAGCTAGCGGCCGCATGCATCGATCTCCTACATCGTATAAATTAGCCTATACGAAGTTATTGCATCTATGTCGGGPCR/Sequencingprimer(SP-R,原命名SP1):PCR/Sequencingprimer(SP-ML,原命名SP2)AscIB-LBsaIBsaIB-RAscINotICCCGACATAGATGCAATAACTTC-3pCas9NLSAscIRBLBBsaI(B-R)P35:HPTNotIpBR322oripBR322bornKanrNLSNotIpYLCRISPR/Cas9-MH(~16.5kb)(NuclearLocalizationSignal)BsaI(B-L)PubiccdBsTnospCas9NLSAscIRBLBBsaI(B-R)P35:BarpVS1repliconNotIpBR322oripBR322bornKanrNLSNotIpYLCRISPR/Cas9-MB(~16.5kb)BsaI(B-L)ccdBsPubiTnospVS1replicon5-NNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-3靶位点PAMG如果这里存在4碱基酶切位点，有利于检测打靶效果19nt4合成接头的形式（左：连接U3启动子；右：连接U6a启动子）注意：接头正向引物F和反向R命名命名是根据靶点在gRNA表达盒的连接方向决定，不是基因方向决定，否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向;另外注意设计引物（尤其反向引物）时的5’---3’方向。（2）如果在NGG上游第20碱基不是A或G，可选20碱基为靶序列（参考KabinXieandYinongYang，2013，MolecularPlant)合成接头的形式（连接U6a启动子）也就是说，所用启动子的转录起始点与NGG上游第20碱基相同的靶点就是19碱基(19+A/G=20)，不相同的靶点就是20碱基。（3）为了提高突变效率，可以对一个目的基因设计2个靶点(尤其只有一个靶基因)。建议在ORF5’区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。靶点序列GC%偏高可提高打靶效率，因此靶点最好含有11-14个C/G（包括U6转录起始点G）。几个靶位点设计例：左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF上游，或在特定的功能域(可能引起密码子缺失和移码)右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切）（4）靶点特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一产生有负面作用的非特异打靶，把突变体与原受体亲本杂交（和回交）就可分离排除非特异打靶位点），但应该将候选靶序列+NGG（上下游加几十碱基）对目标基因组做Blast(选Somewhatsimilarsequences(blastn)，避免在靶序列3’端+NGG与其它功能基因和基因组序列有相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基5-ggcANNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’19nt接头正向引物反向引物5-gccGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’19nt5-gccGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-520ntTTGCGAGCGAGATCGAGCGATGGCGACGGGG-3起始密码PAMCas9切点TAAGAGCATAAGAACGGCGTTAAAAGGGTATGATAATGCAGTATGGTTA-3内含子切点外显子5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-3PAM20nt5因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。3.2靶位点接头引物设计例4.多靶点pYLCRISPR/Cas9-MH(B)载体构建4.1gRNA表达盒构建示意图4.2靶点引物接头与gRNA表达盒的实际连接方式和扩增为了提高接头连接效率，使用较高浓度（0.05-0.1M）的靶点接头，实际上大部分产生线性单端连接，而环状(双端)连接较少。另外，过度酶切，星活性，过度连接等可能产生破坏的平滑末端，有可能连接产生双接头产物或的空载产物（下图的产物IV和产物V）。连接接头后，有3种方法扩增gRNA表达盒片段：（1）直接用位置特异引物做一轮PCR扩增;（2）做2轮巢式PCR，第一轮PCR用通用的U-F/gRNA-R做1个反应，第二轮用位置特异引物扩增；（3）做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，5’-gcctacggccatggtaagtgcccccatcctcttctacccctttgattt-3’3’-ggtaccattcacgggggtaggag-5’ExonIntronborder20bpPAMggcAgaggatgggggcacttaccactcctacccccgtgaatggtcaaa-5’-3’5’-3’-ForU3-gRNAgccGaggatgggggcacttaccatcctacccccgtgaatggtcaaa-5’-3’5’-3’--ForU6a-gRNAgttGaggatgggggcacttaccatcctacccccgtgaatggtcaaa-5’-3’5’-3’--ForU6b-gRNAtcaGaggatgggggcacttaccatcctacccccgtgaatggtcaaa-5’-3’5’-3’--ForU6c-gRNA20bp19bpU3gRNAU3gRNABsaI(1)BsaIdigestionU3gRNATarget-1(T1)ligationBsaI(B1’)NestedPCRU3gRNABsaI(2)U3gRNABsaI(B2)PCRBsaI(B1’)BsaI(B2)pUC8backbone6分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gRNA-R；第二轮为OverlappingPCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。方法（1）效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。方法（2）的扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物IV和产物V。方法（3）虽然第一轮PCR需要做2个反应，但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V，因此推荐使用方法（3）。下图为方法（3）示意图。在第一轮PCR加热过程中（73-75度），有缺口的引物（Tm值低于U3/6和gRNA序列）先解离，U3/6和gRNA序列3’端（未解离）立即延伸补平，产生接头引物互补结合位点。4.3gRNA表达盒扩增引物第一轮PCR扩增引物（所有gRNA表达盒共用）：U-F:5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3;gRNA-R:5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3第二轮PCR扩增引物（使用策略IGoldenGateligation的位置特异gRNA表达盒专用）：U3/6ProTargetadaptergRNAregionTwoBsaI-cutendsarelinkedtodifferentadapterExtensionNestedPCR:U3(6)upstreamprimerU-F/ReverseadapterprimerNickAnnealingFirstPCR(2reactions):Reaction1Take0.1lSite-specificprimer(Bn’)Site-specificprimer(Bn+1)BsaIBsaITheproductIVwithdoubledtargetsequenceareamplifiedintotwodesirablefragmentsII&III,andtheproductVisnotamplified.B