项目三-乳酸菌的筛选及应用

2020/9/131项目三食品中益生菌的分离和鉴别任务一酸乳中乳酸菌的的分离和鉴别吴九玲2012年10月2020/9/132工作过程5.结果3.接种1.备料4.培养2.取样接受指令查找依据制定计划实施操作报告结果2020/9/133乳酸菌的分类乳酸菌的分离和鉴别乳酸菌的应用2020/9/134第一部分、乳酸菌的分类指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌；(1)是一类可发酵利用碳水化合物而产生大量乳酸的细菌。(2)大多数细菌都能产生或多或少的乳酸不能认为凡是产乳酸的细菌都是乳酸菌。分为18个属，共有200多种；大部分是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。一、乳酸菌2020/9/135二、乳酸菌的分类按照Bersy细菌学手册中的生化分类法:乳杆菌属(Lactobacillus)链球菌属(Streptococeus)含5个属明串珠菌属(Leuconostoc)双歧杆菌属(Bifidobacterium)片球菌属(Pediococcus)2020/9/136二、乳酸菌的分类运动性：通常不运动，有的能够运动,具有周生鞭毛。营养类型：化能异氧型需氧情况：微好氧性目前已实际应用的，主要有：德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆茵(L.bulgaricus)瑞士乳杆菌(L.helviticus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophlus)和干酪乳杆菌(L.casei)及其亚种等；短乳杆茵(L.brevis)和发酵乳杆菌(L.fementi)。1、乳杆菌属（Lactobacillus）形态：细胞呈长或细长杆状、大小为0.5～1mx2～10m，弯曲形短杆状,一般成链状排列G(+)，无芽孢菌。2020/9/137形态：细胞呈球形或卵圆形，成对或成链排列运动性：一般不运动营养类型：化能异养型需氧情况：兼性厌氧型2、链球菌属（Streptococcus）(1)一般呈短链或长链状排列，为无芽孢G(+)，兼性厌氧。(2)有些属于人或动物的病原菌:如能引起牛乳房炎的无乳链球菌(S.agalactiae)和人咽喉炎的溶血链球菌(S.haemolytlcus)。(3)有些能引起食物变质而常用于特种干酪(罗马诺干酪)制造上，如粪链球菌(S.faecalis)和液化链球菌(S.liquefaciens)。(4)有些则是发酵乳制品生产上常用的菌种，如乳酸链球菌(S.lactis)、丁二酮乳酸链球菌(S.diacetilactis)、奶酪链球菌(S.creamoris)和嗜热乳链球菌(S.thermophilus)等。2020/9/138形态：细胞球形或豆状，成对或成链排列运行性：不运动营养类型：化能异养型需氧情况：兼性厌氧型3、明串珠菌属（Leuconostoc）2020/9/139形态：细胞呈多样形态：Y字形、V字形、弯曲状、勺形，典形形态为分叉杆菌运行性：不运动营养类型：化能异养型需氧情况：专性厌氧4、双歧杆菌属（Bifidobacterium）2020/9/1310形态：细胞球形，成对或四联状排列运行性：不运动营养类型：化能异养型需氧情况：兼性厌氧5、片球菌属（Pediococcus）2020/9/1311第二部分、乳酸菌的分离和鉴别乳酸菌绝大多数都是厌氧菌或兼性厌氧的化能营养菌。生长繁殖于厌氧或微好氧、矿物质和有机营养物丰富的环境中。具体如下：（1）与动物相关分布：乳汁、消化道、粪便等；（2）与植物相关分布：花蜜、树液、植物残骸、果实损伤部位等；（3）发酵食品：泡菜、酱油、发酵肉制品等；（4）乳酸饮料：酸奶等。一、乳酸菌的分布2020/9/1312（一）溶钙圈法利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。二、筛选方法2020/9/13131、乳酸菌筛选培养基（MRS培养基）配方（1L）:蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g，K2HPO42.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，MgSO4·7H2O0.5g，MnSO4·4H2O0.25g配制：1.调PH至6.2～6.4；2.称取20gCaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液；3.将MRS培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌；4.倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的CaCO3乳浊液，晾干了以后再接种。2020/9/1314备料单培养基：MRS培养基100mlCaCO3乳浊液50ml试管：4支（空）生理盐水100ml1ml刻度吸管5支平皿：3套涂布棒1支试管：4支（装培养基5-10ml）高温灭菌二人一组2020/9/1315样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。2、分离过程2020/9/13164.鉴别菌落挑选——斜面划线——纯化培养染色、镜检2020/9/1317（二）溴甲酚绿指示剂法1、培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）2、筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。2020/9/1318（三）几种乳酸菌筛选举例样品来源：市售酸奶培养基：M17改良培养基培养温度：42℃需氧情况：兼性厌氧筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离1、嗜热链球菌2020/9/13192、保加利亚乳杆菌样品来源：市售酸奶培养基：牛肉浸膏1.5％，酵母浸膏0.5％，葡萄糖3.0％，柠檬酸三铵0.2％，七水硫酸镁0.02％，琼脂1.5％，pH5.1。培养温度：42℃需氧情况：兼性厌氧筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法2020/9/1320样品来源：婴儿新鲜粪便、市售酸奶培养基：MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、PTYG培养基培养温度：37℃需氧情况：严格厌氧筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法3、双歧杆菌2020/9/1321第三部分、乳酸菌的应用一、乳酸菌的生理功能①维持肠道菌群的微生态平衡；②增强机体免疫功能；③预防和抑制肿瘤发生；④提高营养利用率、促进营养吸收；⑤控制内毒素、降低胆固醇；⑥延缓机体衰老。2020/9/1322二、乳酸菌的应用1、乳酸菌在食品、饮料中的应用（1）酸奶；（2）乳酸饮料；（3）酿造调味品中的应用；（4）功能性食品的开发；（5）防腐、保鲜；（6）肉制品加工；（7）腌渍物等。2020/9/13232、乳酸菌在医药中的应用（1）乳酸菌素；（2）γ-氨基丁酸(GABA)2020/9/13243、开发可降解的聚乳酸塑料2020/9/1325（1）聚乳酸（PLA）简介聚乳酸是以微生物发酵产物乳酸为单体用化学合成方法聚合而成的一种高分子材料，它无毒、无刺激性。聚乳酸制品废弃后在土壤或水中，30天内会在微生物、水、酸和碱的作用下彻底分解成CO2和H2O，不会对环境产生污染，因而是一种完全可生物降解的材料。2020/9/1326目前聚乳酸的生产和制备主要有：（2）聚乳酸的生产过程①直接聚合法；②间接法；③聚合法。2020/9/1327（3）聚乳酸的应用①医用领域：如生产一次性输液用具、免拆型手术缝合线、骨科用固定件及手术器件、医用支架、生物导管等；②包装材料：目前，各种包装材料是聚乳酸最大、最有潜力的应用市场。适合于加工一次性饭盒以及其他食品、饮料等外包装材料等；③纤维：聚乳酸纤维是由聚乳酸经常规纺丝工艺制得的生物合成纤维，可制成复丝、单丝、短纤维、针织物、非织造布等，还可用作建筑材料、农业用材等。2020/9/1328PLA作为一个新型的医用、生物可降解塑料在我国有广阔的市场发展前景。生物降解塑料大多数是天然高分子与常用塑料复合体系，或基于天然高分子(主要是淀粉、纤维素)的改性。PLA合成直链脂肪族聚酯，在医用领域是最重要的可降解高分子材料，已越来越受到重视。PLA树脂替代现有降解材料已成为市场发展的必然趋势，并具有与烯烃类聚合物竞争的能力，“绿色生态塑料”的市场前景将十分看好!（4）前景2020/9/1329