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2020/9/13国内外食品微生物检测方法2020/9/13微生物检验标准方法的必要性和重要性有法可依有法必依执法必严违法必究有法可依有章可循有据可查有错必纠有洞必补对食品中的致病微生物进行监测是国家意志的体现食品安全食品政治国家执行部门2020/9/13准确、可靠的检验结果是正确评价和保证食品安全性的先决条件,也是国际贸易上公平交易的有力科学依据。在食品微生物检验领域中,检验规程规范化和分析方法标准化是检验结果可信性的重要保证。避免“公说公有理,婆说婆有理”;避免“仁者见仁,智者见智”2020/9/13内容第一部分国内外食品微生物标准检验体系第二部分微生物检验快速检测系统第三部分方法的选择第四部分微生物检验方法的编写第五部分食品微生物检验方法的验证和确认2020/9/13第一部分国内外的食品微生物标准检验体系一、术语和定义1、标准方法:指国际、区域、国家发布的经过严格确认的以及公认的方法。标准方法包括参考方法和公定方法。(1)参考方法:指适用于特殊待验目标的经过国际或国家公认的检验方法。对于食品微生物检验而言,典型的传统的参考方法是培养法。(2)公定方法:指知名的技术组织或机构(如AOAC)公布的检测方法。2、非标准方法:标准方法中未包含的需要确认后才能采用的方法。可替代方法:指用来检验某一特定产品中某种目标微生物的与相应参考方法等效的方法(ISO16140:2003),如快速检测试剂盒和自动化系统。值得说明的是,并非所有的可替代方法都是标准方法。2020/9/13二、国内外食品微生物检测体系国内主要食品微生物检测体系国家标准(GB)检验检疫行业标准(SN)卫生行标(WS)农业行标(NY)国外主要食品微生物检测体系国际标准化组织(ISO)美国食品药品监督局(FDA)(online)美国官方分析化学师协会(AOAC)美国农业部(USDA)(online)加拿大健康署(HPB)(online)美国公共卫生协会(APHA)北欧食品分析委员会(NMKL)法国标准协会(AFNOR)标准、英国国家标准(BS)、日本国家标准(JIS)、韩国国家标准(KS)等标准方法非标准方法科学书籍和期刊公布的方法;实验室研发的未出版的方法;部分由设备制造商指定的方法;扩充和修改过的标准方法;企业标准;部分协会标准;部分地方标准等。食品微生物检测方法标准方法未包含的方法食品中常规指示菌和致病菌的关系好氧菌总数肠杆菌科大肠菌群粪大肠菌群大肠杆菌沙门氏菌致泻性大肠杆菌金黄色葡萄球菌粪链球菌弧菌科单增李斯特氏菌志贺氏菌芽孢杆菌O157厌氧梭菌弯曲菌2020/9/13常规指示菌和致病菌的“危害分类”VeryfewmicrobesarealwayspathogenicManymicrobesarepotentiallypathogenicMostmicrobesareneverpathogenic如霍乱弧菌、O157、单核细胞增生李斯特氏菌等如肠球菌、蜡样芽孢杆菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌等如乳酸杆菌、双歧杆菌等2020/9/13食品微生物检测方法方法定量方法定性方法直接计数方法细菌总数*、大肠菌群*、大肠杆菌*、肠球菌*、金黄色葡萄球菌*、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、弯曲菌属、肠杆菌科*、副溶血性弧菌、亚硫酸盐还原梭菌、李斯特氏菌属、霉菌和酵母菌数*、嗜冷菌*、乳酸菌、双歧杆菌等间接计数法(MPN法)大肠菌群*、粪大肠菌群*、大肠杆菌*、肠球菌*、金黄色葡萄球菌*、蜡样芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌、肠杆菌科*、副溶血性弧菌、亚硫酸盐还原梭菌等致病菌:单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、O157、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、肉毒梭菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、产毒霉菌等带*者通常被列为食品卫生指示菌2020/9/13传统直接计数法平板倾注法平板涂布法2020/9/132020/9/132020/9/13MPN法适用于污染程度低,含有受到损伤的加工食品,目标微生物数量低,否则,应用直接计数方法间接计数法——最大可能数量(MPN)2020/9/13三、区分几个关系1、国家标准与行业标准的关系?食品微生物检验的国家标准是GB/T4789,其为基础标准,行业标准方法原则上应与其一致,至少不能与国家标准相矛盾。进口产品用GB???出口产品用SN??????2、国家标准与国际标准的关系?为了公平贸易,国家标准应与国际标准接轨。应考虑优先使用国际标准。现状。实例:2004年USDA来青进行等效性评估。3、[国内]国家标准/行业标准与[他国]国家标准/行业标准的使用?根据ISO/IEC17025的规定,如果进口国要求使用他国国家标准/行业标准,原则上要满足客户的要求,否则,需与客户协商。即使国内国家标准/行业标准与他国国家标准/行业标准等效或等同,也必须与客户协商和沟通,只有做客户统一的情况下方可使用。2020/9/13第二部分微生物快速检测系统2020/9/13第一节主要微生物检验快速检测系统一、以免疫学为基础的检验法2020/9/13免疫磁珠检验法的优点:特异性好灵敏度高≤1CFU所捕获的菌是活菌快速、操作步骤简便可快速处理较大量样品2020/9/132020/9/13商业化免疫磁珠有:沙门氏菌O157:H7单核细胞增生李斯特氏菌VTECO145VTECO111VTECO103VTECO26等等SN/T***-****进出口食品中产志贺氏毒素大肠杆菌的检验方法2020/9/13可筛选沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌O157、李斯特氏菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特氏菌、葡萄球菌肠毒素;可免疫浓缩沙门氏菌、免疫浓缩肠出血性大肠杆菌O157Mini-VIDAS自動微生物筛选儀2020/9/13二、以分子生物学为基础的检验法DIN10135:1999《沙门氏菌聚合酶连锁反应(PCR)检验方法》、ISO/TS20863:2005《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR)检测食源病原体—热循环器的性能试验》、ISO/TS22174:2005《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR)检测食源病原体—通用要求和定义》、ISO20837:2006《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR)检测食源病原体—定性检测用样品的制备》、ISO/TS20838:2006《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR)检测食源病原体—定性方法的扩增和检测条件》、HealthCanadaMFLP-72、USAFDABAM第9章和USAAPHA第40章规定可用PCR检测食品中的致病弧菌(如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌等)、HealthCanadaMFLP-24和USAFDABAM第24章和USAAPHA第35章规定可用PCR检测食品中产志贺氏毒素的致病大肠杆菌和霍乱弧菌。SN/T1632.2:2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第2部分:PCR方法》SN/T1632.3:2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分:荧光PCR方法》PCR检测食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、产志贺氏毒素大肠杆菌等致病菌的SN均在报批中,即将发布。2020/9/13PCR技术将是众多食品微生物快速检测中被认可的一枝独秀的快速检测技术之一。但须注意:如何减少培养基成分的干扰?死菌的干扰和风险?等等2020/9/13基因芯片-DNA点样仪基因芯片的基本技术路线1、采用数据库中各种微生物的全基因组序列资料或部分基因组序列资料,通过生物信息学方法找出各种微生物的特异序列,每个检测目标找3-5个特异序列,每个序列长度为25-75mer。并设计五条阴性序列(这些序列不代表任何一个待分析的微生物)。2、合成上述特异序列(探针)。探针将不是传统的cDNA形式,而是oligo寡聚核酸,这样将大大提高检测灵敏度。3、利用基因芯片点样系统将探针点样到载体上。同一种微生物的特异性探针点样到芯片的一个区域。4、寻找适当的方法,提取微生物的基因组核酸。5、加入相应的引物、荧光染料或用分子信标的方法,通过PCR扩增特异性片段。6、将带有荧光染料标记的核酸与基因芯片杂交。7、杂交结果由基因芯片扫描仪进行扫描判读,对于管帽芯片也可用荧光显微镜进行观察。8、结果分析,针对杂交阳性位点,找出对应的阳性样品。SN/T1543:2005食源性致病菌基因芯片鉴定方法2020/9/13三、生化鉴定系统2020/9/13BDPHOENIX™全自动微生物鉴定系统大肠杆菌(G-)沙门氏菌(G-)志贺氏菌(G-)弯曲杆菌(G-)弧菌(G-)小肠结肠炎耶尔森氏菌(G-)金黄葡萄球菌(G+)李斯特氏菌(G+)***产气甲膜梭菌(G+)肉毒梭菌(G+)链球菌(G+)炭疽杆菌(G+)双歧杆菌(G+)乳酸菌(G+)VITEK2COMPACT2020/9/13四、根据酶触反应及代谢产物快速检测细菌2020/9/132020/9/132020/9/13五、其他部分自动化系统2020/9/13BIOLOG自动微生物鉴定系统BIOLOGOmniLog&OmniLogPlusMicroLog1MicroLog2MicroLog3(MicroStation)OmniLogMicroLog2020/9/13第二节微生物快速检测系统的局限性大部分快速方法适用于检测单一微生物,适用于质量控制程序中快速筛选大量食品样品中所存在的特殊病原体或毒素。然而,快速检验方法所得阳性者,仅仅是可疑,必须用标准参考方法予以证实,虽然证实试验需要几天,但不能予以限制。快速检验方法的评估结果表明,其对于某类食品的性能优于其它食品,很大程度上是由于食品成分干扰所致,有些食品成分对于快速方法中所应用的技术是比较麻烦的。例如,每一食品成分可能抑制DNA杂交或Taq聚合酶,但对抗原-抗体相互作用没有影响,反之亦然。既然方法的灵敏度、特异性和精确性依赖于待验食品,那么进行比较研究以确保某一特殊检验方法能有效分析此类食品是明智的。2020/9/13基于DNA检验方法的特异性通过短的探针来显示,因此用特殊探针或引物检测毒素基因,阳性结果仅仅表明某细菌具有该基因序列,以及某细菌可能是产毒的,不能从客观上说明该基因得以表达,并产生毒素,例如在梭菌和葡萄球菌中毒病例中,DNA杂交和PCR仅能检测到基因的存在,但不能用来检测预先形成的毒素是否存在。随着某一快速方法更加频繁的使用,其好处和局限性同时变得更加明显。使用者在选择和彻底评估这些快速方法时,必须保持谨慎。2020/9/13FDA认可使用的检测系统和试剂盒检测和鉴定食源性病原菌的微量生化复合试剂盒微生物自动鉴定系统核酸杂交分析(分子生物学)方法免疫学分析方法其它商品化快速检测方法和培养基第三节微生物快速检测系统的认可一、USDAFDA认可情况2020/9/132020/9/132020/9/132020/9/132020/9/132020/9/132020/9/13二、AOAC、NMKL、AFNOR、NORDVAL、MICROVAL的认可情况AOAC指南美国管理者(USregulators)ISO16140AOAC研究所NMKLNordValMicroValAOAC&OMA非美国管理者,如NATAAFNOR认可微生物快速检测系统的主要知名技术组织或机构的相互关系认可(agreement)逐步淘汰(phasingout)2020/9/13第三部分方法的选择1.客户要求;2.方法的准确性;3.方法的特异性;4.方法的实用性;5.方法的稳定性;6.方法的灵敏度;7.方法的检测限和测量限;8.实验室硬件条件(仪器、设备、场地设施、人员资质等);9.商业快速检测系统的供应保证、价格、认可程度和售后服务。2020/9/13通常情况下,实验室应采用满足客户(注:对于企业实验室,其所在单位为其内部客户)需要并适用于所进行的检测的方法,包括在抽样的方法。应优先
本文标题:国内外食品微生物检测方法
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