第十五章细胞工程与作物育种

第十五章细胞工程与作物育种Chapter15CellEngineeringandCropBreeding第一节植物的细胞和组织培养技术第二节细胞和组织培养与作物育种第三节植物原生质体培养和体细胞杂交细胞工程：（plantcellengineering）以细胞为单位，在体外（invitro）条件下进行培养、繁殖或人为使细胞的某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。包括花药培养、体细胞变异筛选、幼胚培养、试管受精和原生质体融合等。理论基础细胞的全能性（celltotipotency）：因为细胞核内有保持物种遗传性所需要的全套遗传物质所以高度分化的体细胞具有发育成一个生物体的能力。第一节植物的细胞和组织培养技术一、培养基及其组成植物组织培养中常用的培养基主要区别在于无机盐的种类与含量。有的植物生长要求无机盐含量较高,而另一些植物则相反。（一）培养基的种类和特点1.MS及其类似的培养基2.硝酸盐含量较高的培养基3.中等无机盐含量的培养基4.低无机盐培养基1.MS及其类似的培养基(1)MS培养基（Marshing和Shong，1962）MS培养基的无机盐成分对许多种植物均是适宜的。它的无机盐含量和离子浓度较高，微量元素种类较全，养分平衡，浓度也较高。(2)LS培养基(Linsmainer和SKoog,1965)其成分是大量元素、微量元素及铁盐,与MS培养基相同,有机物质中仅保留MS培养基的盐酸硫胺素0.4mg/L及肌醇100mg/L,蔗糖3%。(3)BL培养基(Botton和Lawrene,1968)成分和MS培养基类似。(4)BM培养基(Button,1975)成分与MS培养基类似,仅将盐酸硫胺素除去,蔗糖为3%。(5)ER培养基(Eriksson,1965)成分与MS培养基相似。2.硝酸盐含量较高的培养基(1)Bg培养基(Camborg等,1968)它含有较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,较低的氨态氮。(2)N6培养基(朱至清等,1975)成分较简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高，广泛用于植物的花药培养。(3)SH培养基(Scken和Hildebrandt,1972)它是矿质盐浓度较高的培养基,其中铵与磷酸是从NH4H2P04提供的。3.中等无机盐含量的培养基(1)H培养基(Bourgin和Nitsch,1967)H培养基大量元素(无机盐)是MS培养基的一半,微量元素种类减少而浓度较MS高,维生素种类则较MS多。(2)Nitsch(1969)培养基与H培养基成分基本相同,仅生物素较H培养基高10倍。(3)Miller(1963)培养基和Blaydes(1966)培养基二者成分完全相同,与MS培养基比较,无机元素用量减少1/3~1/2,微量元素种类减少,无肌醇。4.低无机盐培养基(1)White(WH)培养基无机盐的种类及用量均少于MS培养基,约为MS的1/3。(2)WS培养基(Wolter和SKoog,1966)适于进行生根培养。(3)HE培养基(Heller,1953)钾盐和硝酸盐是通过不同的化合物来提供的。(4)改良Nitsch(1951)培养基常用于花药和胚培养。(5)HB培养基(Holley和Baker,1963)J用于一些花卉植物(如康乃馨)的脱毒培养效果良好。（二）培养基的成分无机盐和水大量元素C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl微量元素Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na水蒸馏水、双蒸水或使用去离子水有机化合物糖碳源和能源氨基酸类有机氮源维生素类维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等生长调节物质生长素IAA、NAA、2,4-D、IBA细胞分裂素天然：6-BA、KT（激动素，糠基酰嘌呤）人工：ZT（玉米素）、2-iP赤霉素GA3成份不定物质椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥琼脂从海藻中提取的一种高分子碳水化合物二、培养基的配制(1)水和药品水必须采用蒸馏水或无离子水，药品最好采用分析纯，至少是化学纯药品。(2)母液的配置为方便培养基的制备，现将培养基的各种成份分类配成浓缩的母液，正式配制时按规定用量稀释混合。(3)制备培养基(4)培养基的消毒主要有高温高压灭菌和过滤灭菌两种方法。三、无菌操作方法（一）消毒剂消毒剂使用浓度（%）消除难易消毒时间（min）消毒效果次氯酸钠2易5-30很好次氯酸钙9-10易5-30很好过氧化氢10-12最易5-15好溴水1-2易2-10很好硝酸银1较难5-30好氯化汞0.1-1较难2-10最好抗生素4-50mg/L中30-60较好（二）无菌操作（三）无菌培养第二节细胞和组织培养与作物育种一、体细胞克隆变异及其育种利用（一）体细胞克隆变异的遗传基础染色体数目变异染色体结构变异点突变（二）突变体的筛选（三）在作物改良上的应用抗病抗除草剂抗氨基酸或氨基酸类似物耐盐耐旱优良品种细胞培养R0R1群体改良的体细胞克隆遗传稳定性测试育成新品系区域试验审定投入生产田间试验多点田间试验继续田间试验,种子富集互交测试确定遗传方式利用体细胞克隆变异育种的技术路线二体细胞变异体和突变体的筛选体细胞无性系变异：植物体细胞发生的可遗传变异变异体：不加任何选择压力而筛选出的变异个体突变体：经过施加某种选择压力而筛选出的变异个体有些变异发生在植株的某一部分组织的细胞中，需将这部分变异的细胞从植株上分离下来进行培养，使之再生植株。1组织培养之前的变异及其选择在组培过程中,对培养物施加某种处理,使之发生变异后再进行选择。2组织培养期间的变异及其选择培养基中不含有特定的选择因子，但含有诱变剂，由此产生的再生植株可能出现优异变异。3组织培养后的选择鉴定4体细胞无性系选择的几个问题1)选择目标的确定经济性状；基因数目；显隐性2)外植体的选择基因型、器官或组织、年龄外植体：用来进行培养的植物的某一部分组织的统称再生植株由愈伤组织直接分化而成。通常,外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织的一部分形成类似生长锥的分化物，进而发育成幼芽；另一部分愈伤组织则分化成幼根，这两部分进一步发育和联合即形成一个新的植株。3)培养系统的选择：A器官发生系统：外植体首先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出类似于种子胚的胚状体，胚状体进一步发育成熟而形成完整植株。B胚胎发生系统：4)无性系变异的选择A在大量无性系中筛选出并发变异少的个体B选择两个具有目标性状的无性系杂交，从后代筛选出无不良变异的重组体三离体培养技术与植物育种1通过胚珠或子房培养与试管受精，克服远缘杂交不亲和性2使远缘杂种的胚发育成熟3克服核果类植物胚的后熟作用4打破种子休眠四细胞与组织培养的其他利用途径1快速繁殖2种质保存3产生无病毒植物材料第三节原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。概念一利用原生质体制造单细胞无性系二植物体细胞杂交（原生质体融合）1）选择合适的实验材料2）酶的类型和处理条件：果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等1原生质体的分离与培养3）原生质体计数0.25MNaNO3和高浓度Ca2+,聚乙二醇（PEG）加高浓度Ca2+和高PH值，电融合技术2原生质体融合关键是融合剂的选择：融合后的细胞类型3杂种细胞的鉴别和选择1)用选择性培养基使杂种细胞有选择性地生长2)互补选择法3)异核体机械分离和杂种细胞的核型鉴定4)杂种和胞质杂种的鉴别A花部和营养体的形态观察；B细胞学检测C生化鉴定5）分子生物学分析AHHHHHHB思考题如何利用体细胞克隆变异培育新品种？单倍体细胞培养在作物育种中有什么应用价值？细胞和组织培养技术在植物育种中有什么作用？举例说明。