马传染性贫血课件

马传染性贫血EquineInfectiousAnemia（EIA）马传染性贫血病简介马传染性贫血，是由马传染性贫血病毒引起马属动物的一种慢性传染病，以病毒持续感染、反复发热和贫血为特征，且可人畜互传，一旦发生很难消灭。流行病学病马和带毒马是本病的传染源，其血液、肝、脾、淋巴结等均有病毒存在，发热期病马分泌物和排泄物也含有病毒。吸血昆虫（蚊、虻等）是主要的传播媒介，也可经消化道、呼吸道、交配、胎盘传染，也可由被病毒污染的注射针头和诊疗器械等散播。仅马属动物易感，其中以马最易感，驴、骡次之，且无品种、年龄和性别差异。本病主要呈地方流行或散发。一般无严格的季节性和地区性，但在吸血昆虫较多的夏秋季节及森林、沼泽地带发病较多。在新疫区以急性型多见，病死率较高，老疫区则以慢性型、隐性型为多，病死率较低。病原学马传染性贫血病毒（EIAV）为RNA病毒，属于反转录病毒科慢病毒属。病毒粒子呈圆形，有囊膜，以出芽方式成熟和释放。病毒有群特异性抗原，用补体结合反应和琼脂扩散反应可以检出，主要用于本病的诊断。另还有型特异性抗原，是各型毒株间不同的抗原，存在于病毒粒子表面，可用病毒-血清中和试验检出，主要用于病毒型的鉴别。本病至少有14个型。病毒只在马属动物白细胞及驴胎骨髓、肺、脾、皮肤、胞腺等细胞培养时才可复制。用马属动物以外的其它动物人工感染和进行细胞培养均未获成功。病毒对外界的抵抗力较强。在粪便中能生存两个半月，将粪便堆积发酵时，经30分钟即可死亡。2%～4%氢氧化钠液和福尔马林液，均可在5～10分钟内将其杀死，3%来苏儿液可在20分钟内杀死。日光照射1～4小时死亡。在-20℃左右病毒可保存毒力达6个月到2年。病毒对热的抵抗力较弱，煮沸立即死亡。临床症状临床特征以发热(稽留热或间歇热)为主，并有贫血、出血、黄疸、心机能紊乱、浮肿和消瘦等症状。血相变化：红细胞显著减少，血红蛋白降低，血沉加速。白细胞减少，丙种球蛋白增高，外周血液中出现吞铁细胞。在发热期，嗜酸粒细胞减少或消失，退热后，淋巴细胞增多。根据临诊表现，可分为急性、亚急性、慢性和隐性四种病型。病理变化急性型呈现全身败血变化。浆膜、黏膜、淋巴结和实质脏器有弥漫性出血点(斑)。脾急性肿大，暗红或紫红色，红髓软化，白髓增生，切面呈颗粒状。肝肿大，黄褐色或紫红色，肝细胞索变性与中央静脉、窦状隙淤血交织，使肝切面形成豆蔻状或槟榔状花纹，有“豆蔻肝”或“槟榔肝”之称。亚急性和慢性病主要是脾、肝、肾、心脏及淋巴结等的网状内皮细胞的增生，肝脏内见有多量吞铁细胞。长骨的骨髓红区扩大，黄髓内有红髓增生灶，慢性严重病例骨髓呈乳白色胶冻状。马传染性贫血驴白细胞活疫苗用马传染性贫血病毒(EIAV)通过驴白细胞人工驯化而制成的疫苗。为中国首创，可刺激马、驴产生明显体液和细胞免疫应答，保护率分别达85%以上(马)和100%(驴)。对马、驴接种后免疫力的产生虽较缓慢,但免疫持续期较长，免疫保护率较高。这是目前国际上唯一的马传染性贫血活毒疫苗,该成果达到国际先进水平。毒种选择毒种：马传贫驴白细胞弱毒。（毒力弱，免疫原性良好。）应符合条件：毒种病毒液含毒量对培养的驴白细胞≥106TCID50/ml；病毒液对驴最小感染量与免疫量≤10-5/ml；病毒液对标准琼扩、补体结合反应的阳性血清必须有抗原性，与补体抗原效价应在3.0以上；接种健康马属动物不出现马传贫症状和不引起死亡，但具有血清学反应。制造要点驴白细胞培养：动物选择，供提取驴白细胞的驴为2~5岁无马传贫感染的健康者。无菌采取血浆并分离出白细胞，加赛氏液（Seligmarls）与牛血清混合的营养液培养48h。接毒按3%量接毒后，继续培养。收获病毒再培养5~7d进行，收毒冻融二次。质量标准疫苗需无菌；补体结合试验效价不低于2.0；驴白细胞做毒力测定不低于105TCID50/ml；原苗5ml皮下注射健康马，观察3个月，每天测温两次，每2Od进行补体结合反应检验；须无马传贫症状；血清阳性率需达到2/3~3/4，苗可判为合格。保存与使用液体苗0~4℃可保存7d，-20℃以下可保存一年。冻干苗0~4℃可保存6个月，-20℃以下可保存两年。液体苗为微黄色澄清液体。冻干苗为微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。按瓶签注明头份，用PBS缓冲液稀释，马、驴、骡各皮下注射2毫升。注苗后，马需3个月，驴、骡需2个月才能产生免疫力，免疫持续期为2年。诊断制剂1、马传贫琼脂扩散反应抗原毒种：驴胎肺、真皮、胸腺二倍体细胞上培养传代适应，抗原性良好的马传贫病毒。毒种条件：收毒后冻融三次，无菌收集。按1.5%沉淀物制出抗原，免疫扩散法测定效价，扩散环直径10mm以上。制造要点：将6月龄左右驴胎肺、皮肤、胸腺等组织制成二倍体细胞，换入等量维持液，按2%-5%接种，培养10-15d收毒。调pH至5.0,4℃透析15h，离心，弃上清，沉渣以pH8.6硼酸缓冲液稀释，再加乙醚研磨，待乙醚挥发后重复一次处理后即为抗原。抗原检验：用含8个单位标准阳性血清，配置成含1%标准阳性血清的1%琼脂平板，经反应后出现沉淀环者即为合格。2、马传贫补体结合反应抗原独到特点：应用驴白细胞或驴胎肺、骨髓传代细胞生产抗原；把小牛血清改为大牛血清；把乙醚处理病毒培养物改为吐温-80（非离子型表面活性剂）和乙醚等量联合处理，大大增加抗原生产量。3、ELISA抗原马传贫疫苗研究意义马传贫疫苗的研究成功，突破了慢病毒不能免疫的理论，对慢病毒的免疫预防提供了战略性的理论依据，蕴含着慢病毒免疫的巨大信息，为一系列人畜慢病毒免疫的研究开辟了新的路线，马传贫疫苗作用机理的阐明将为AIDS疫苗的研究提供借鉴。原来，马传贫疫苗是采用传统的细胞学方法研制出来的，这种旨在使病毒在细胞传代培养的过程中减低毒力的方法，不但所用的时间较长，而且由于受到技术手段的限制，研究者只能看到它最终的结果，却并不能了解其中的免疫机理，无从知晓一个原本可以使动物致死的病毒究竟何时变成有免疫保护作用的疫苗了。如今，运用现代分子生物学技术就能弥补传统细胞学技术知其然、不知其所以然的缺憾。马传贫病毒与艾滋病病毒的主要遗传信息的基因结构完全相同，所以，只要找到马传贫病毒基因中的有毒部分，就可以确定HIV中带毒基因的位置；如果将HIV的这部分基因减掉后其毒性也随之消失的话，艾滋病致人死地的谜底就将被揭开。因此，首当其冲的是要找到马传贫病毒中这段关键的致病基因。此时，保存了20年的马传贫疫苗几百代传代样本就派上了大用场——各代病毒的毒力是怎样减下来的，免疫原性是怎样提上去的，这些信息对于艾滋病疫苗的研制有着重要的指导作用。在完成了一系列不同层面的基因对比后，研究人员终于找到了那些缺失或突变的基因位点，并以实验证实了马传贫疫苗的减毒原理：这些位点中的某些突变，就是使马传贫病毒从有毒变无毒，进而激发马体产生免疫保护的关键所在。科学家们在HIV的基因组中引入了马传贫疫苗株的这种突变，HIV的结构也出现了类似马传贫疫苗株的那种变化；按照这种方法改造的艾滋病抗原，其免疫原性也比原来大大提高了。据此，科学家认定，把这种马传贫疫苗的经验移植到艾滋病疫苗的设计上是可行的。