bb基因诊断、治疗

2019/9/21基因诊断与基因治疗GeneDiagnosisandGeneTherapyLaboratoryofMolecularVirology,InstituteofVirology,WuhanUniversitySchoolofMedicine2019/9/22第一节基因诊断（genediagnosis）一、定义：Definitionofgenediagnosis基因诊断：用分子生物学技术对导致疾病的原因进行病原学和细胞遗传基因的检测分析,从而对相应疾病进行诊断。Geneticdiagnosisisatestusingmolecularbiologytechnologiestoseekthecausesofdiseasesthroughanalysisofpathogensandgenes.2019/9/23基因诊断的靶分子是基因。Thetargetsofgenediagnosisaregenes2019/9/24传统的疾病诊断：Conventionaldiagnosticapproaches•细胞形态、数量•celluarmorphology&celluarquantity•生化反应、酶活性biochemicalreaction,activitiesofenzymes•免疫学检验Immunologictests2019/9/25检测表型或形态学改变detectionofphenotypicormorphologicfeatures检测对象是基因的产物--蛋白质、多肽。Detectionobjectsareproductsofgenes,suchasprotein,polypeptide2019/9/26二、基因诊断常用的技术：Technologiesincommonuse1.分子杂交技术(Nucleicacidmolecularhybridization)2.PCR技术(Polymerase-Chain-Reaction)3.以上二者的衍生技术（包括DNA芯片）derivativetechnologiesfromabovetwotechnologies,DNA-Chips4.DNA序列测定DNAsequencing2019/9/27基因诊断独特的优点：Advantagesofgenetherapy从分子水平上找到特异的致病基因Tofindpathogenicgenesatthemolecularlevels具有很高的灵敏度Highsensitivity2019/9/28•获得稳定的结果StableResults核酸比蛋白质稳定Nucleicacidismorestablethanthatofprotein.•快速、早期诊断技术Speedy&early甚至在未出现症状的情况下早期诊断•应用广、适用性强Wideapplicability2019/9/29三、基因诊断策略Strategiesforgenetherapy（一）通过致病基因的检测诊断疾病Diagnosisofdiseasesviapathogenicgenes2019/9/210基因的结构清楚、突变点明确、致病机制基本清楚。Structure,mutationandpathogenicmechanismofpathogenicgenesareclearlyunderstood.2019/9/2112019/9/2121)单基因遗传病eg.monogeneticorsingle-genedisease镰状细胞贫血Sicklecellanemia→珠蛋白基因globingeneCodon6GAG→GTGA-T突变(mutation)谷氨酸(glutamic)→缬氨酸(valine)2019/9/2132)、Gene缺失遗传病的诊断1)α地贫的Gene诊断•α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个αGene时可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe2019/9/214以αGene为探针，Southernblot方法检测αα/αααα/α-αα/--α-/----/--•正常缺1缺2缺3缺414kb10kb2019/9/2153)DMD/BMD的缺失诊断（进行性肌营养不良或假肥大型）•DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症状与DMD相似，但症状较轻。•Gene定位Xp21，Gene2300kb,79个Exon，cDNA全长13974bp编码3685Aa，分子量427kD。•DMD/BMD70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重PCR扩增检测，判断缺失状态。2019/9/216（二）通过连锁遗传标志检测诊断疾病Diagnosisvialinkagegeneticmarker基因结构、突变情况不清楚，但已知定位在染色体的特定位置上。Chromosomelocationofpathologicgenesisclear,butthestructureandmutationofthegenesareunclear.2019/9/217同一染色体上位置十分靠近的基因或其他遗传标志,常常一起遗传,形成连锁（linkage）.Thegenesorothergeneticmarkerslocatednearatthesamechromosomecanbeinheritedtogether,andtoformlinkage.2019/9/218例如：具体基因不明的遗传病Hereditarydiseasecausedbyunidentifiedgenes用内切酶切正常母亲DNA，杂交后出现7.6kb带；同酶同方法检查有遗传病的父亲，发现6.0和7.6kb两种片断，表明6.0kb与基因病有连锁关系。这样当胎儿羊水或胚胎绒毛细胞同样处理后，仅出现7.6kb片段，表明胎儿正常，如果同时有6.0和7.6时，表明胎儿携带有父亲的遗传病基因。2019/9/2191、Gene异常不明确的遗传病的诊断•例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。•APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKDGene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。2019/9/220•以3`HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的Gene组DNA杂交——SouthernBlot杂交•Gene组DNAprobe（3`HVR）•PvuII酶切DNA片段••杂交结果2019/9/221英国女王维多利亚。她带有血友病的基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有17人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。2019/9/222PCR—RFLP诊断•甲型血友病的基因诊断，已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA。•PCR142bp•BcLI••142bp99bp43bp•电泳•结果分析•？p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+2019/9/223问:1/Ⅱ2、Ⅲ1诊断；2/Ⅲ1是男或是女发病？••142bp99bp12123ⅠⅡIII12019/9/224结果分析•1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。•2）II2有142bp/99bp杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。•3）Ⅲ1为99bp片段•如果是男性为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）2019/9/225•连锁分析(geneticlinkageanalysis)就是在家系成员中寻找患病成员共同具有的比正常成员出现频率更高的染色体片段.•Thesearchforcertainchromosomefragmentsthatarefoundinpeoplewithadisorderaremorefrequentlythanyouwouldexpectinpeoplewithoutthedisorder.2019/9/226•在这个区域内具有疾病倾向的基因Thegenewithsusceptibilitytodiseaseislocatedintheregion.2019/9/227遗传标记选择Geneticmarkerselection：多标记原则Mult-markerprinciple靠近原则Convergenceprinciple2019/9/228•不是寻找DNA缺陷(DNAdeficiency),而是通过分析DNA遗传标记多态性来判断被检者是否具有带致病基因的染色体,判断被检者患病的可能性Itisananalysisofpolymorphismofgeneticmarkertodecidewhetherthechromosomeiscarryingthepathogenicgene,butnotasearchforDNAdeficiency.2019/9/229（三）通过基因表达的定量分析诊断疾病Diagnosisofdisordersviaquantitativeanalysisofgeneexpression基因表达水平的变化,可引起相应蛋白质的含量变化。variationingeneexpressionlevelsisrelatedtovariationinitsproteinlevels2019/9/230定量PCR技术可用于基因诊断，也可用于治疗效果监控。Applicationofreal-timepolymerasechainreactiontogenediagnosisandmonitoringoutcomeoftherapy2019/9/2312019/9/232四、基因诊断存在的问题及前景Problemsandprospectsinthegenediagnosis1、理论问题theoryproblems.2019/9/233已找到的致病基因不多，弄清机制的就更少。基因诊断失去了基础。Littleisknownaboutpathogenicgenes,andlessisknownaboutthemechanism.Genediagnosislosesitsfoundation2019/9/2342、技术问题technicalproblems•对设备及条件要求高、所需试剂价格昂贵。highrequirementsforequipmentsandconditions&highexpenseforessentialregents2019/9/235•技术复杂、精细，对操作人员的要求高。•Thevarietyandcomplexityoftechnologyhasalsogrownandweneedaprofessionthatdealswiththissituation2019/9/236•技术灵敏度高，很容易受到污染而出现假阳性。•Falsepositiveresultsmaybeobtainedbycontaminationduetothehighsensitivityoftechniques.2019/9/2373、伦理问题ethicalconcerns可能引起基因歧视（Itmaycauseageneticdiscriminationbygenediagnosis）2019/9/2382019/9/239基因诊断的发展前景Futureprospectsfor