TSPOTTB技术用于辅助诊断结核临床病例报道

TSPOTTB技术用于辅助诊断结核临床病例报道莫凌，孟成艳，张舒，金嘉琳，张文宏作者单位：200040上海，复旦大学附属华山医院感染科通讯作者：张文宏，Email：[e-mail]退修稿：0074基金项目：国家重点基础研究发展计划（2005CB523102）近年来，我国结核病的发病率有上升趋势，临床上经常会遇到一些症状不典型的结核病和肺外结核病，而目前可用于诊断结核病的方法有限，同时又缺乏快速敏感的实验室技术，为结核病的早期诊断与治疗带来困难。ELISPOT（enzyme-linkedimmunospotassay,酶联免疫斑点法）技术是一种新型的免疫酶技术，它是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞[1]。由ELISPOT发展来的TSPOTTB（结核感染T细胞斑点试验）技术就是通过检测结核感染后T淋巴细胞分泌的特异性的细胞因子IFN-γ来诊断是否存在结核感染。1．ELISPOT技术原理该方法源于Mahairas等在1996年发现的一段存在结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列[2]，而在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏RD1序列。RD1编码产生两种蛋白：ESAT-6和CFP-10（culturefiltrateprotein），ESAT-6和CFP-10作为特异性抗原刺激机体T淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN-γ。根据这一原理，TSPOT技术利用结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌γ干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。外周血单核细胞，结核特异的混合抗原A和混合抗原B（分别为ESAT-6和CFP-10的部分多肽片断），对照试剂一起加入预先包被抗γ干扰素抗体的微孔培养板进行培养。当外周血单核细胞中存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞时，培养液中加入的结核杆菌特异混合抗原多肽A和B将刺激这些效应T淋巴细胞分泌γ干扰素。分泌的γ干扰素被微孔板上的抗体捕获，再次加入的碱性磷酸酶标记并针对γ干扰素不同表位的抗体与被捕获的γ干扰素结合，滞留在微孔板表面。显色底物溶液在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每一个斑点代表一个γ干扰素分泌细胞（结核特异的效应T细胞）。通过对斑点进行计数可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。2．ELISPOT操作方法采集8ml患者的血液加入含柠檬酸钠的CPT采血管，分离外周血单个核细胞（PBMC），加入细胞培养液，轻轻重悬细胞。在已包被抗IFN-γ抗体的微量板的4个孔中，分别加入细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素PHA作为阳性对照，结核分枝杆菌特异混合多肽A和B，分别含ESAT-6与CFP-10（OxfordImmunoteLtd.,Oxford,UK）。然后在每个孔中加入含250000个细胞的上述悬液。把微量板放在37℃培养16-20小时后，用PBS液洗板4次，加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗人IFN-γ单抗，在2-8℃下孵育1小时。孵育后再用PBS液洗板4次。最后每孔加入显色底物液BCIP/NBTPLUS，室温中静置7分钟后观察结果，并用计算机辅助成像分析系统进行斑点阅读与统计（ELISPOT试剂盒由上海复星科技有限公司提供）。第一孔为阴性对照孔，第二孔为阳性对照孔，如出现斑点，说明试验成功。第三，四孔为实验孔，当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果：（1）如果阴性对照孔斑点数为0-5个，测试孔斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6。（2）如果阴性对照孔斑点数≥6个，测试孔斑点数必须≥2倍的阴性对照孔斑点数。3．ELISPOT的临床应用我院传染科首次将TSPOTTB技术用于临床，辅助诊断疑似结核患者，为结核病的诊断提供了一项新的技术，并取得一定成效。现将一例经TSPOTTB技术鉴别诊断后得到有效治疗反应的病例报道如下。3．1．病例报道患者，男，62岁。入院前3月无诱因下出现颈部疼痛,一月前出现左上肢麻木,进行性乏力，伴发热，体温在38度左右，无畏寒，寒战，无咳嗽，咳痰，无消瘦，盗汗等。入院查体，精神较萎，左侧颈部可扪及肿大淋巴结，质软，无压痛。心肺无特殊，腹软，肝脾肋下未及。颈软，克氏征（-），布氏征（-），余病理征均阴性。左上肢肌力3级，肌张力可，余肢体肌力，肌张力正常。辅助检查，血常规：白细胞9.42×109/L,中性粒细胞72%。脑脊液：白细胞2×106/L，总蛋白983mg/L,葡萄糖3.9mmol/L,氯化物120mmol/L。脑脊液抗酸染色，细菌涂片培养，真菌涂片培养均阴性。颈椎MRI：多发椎体异常信号伴硬膜增厚（图1）。头颅MRI示：双侧额叶、侧脑室旁多发斑点状异常信号（图2）。高度怀疑颈部与颅内异常信号为转移性肿瘤可能大，但骨髓穿刺，腹部B超，腹部CT，颈部淋巴结活检均未发现异常。PPD（-）。图1：A图为该患者治疗前颈椎MRI：在颈2-4椎体之间有异常信号，并有硬脊膜增厚。B图为治疗后同一部位的MRI：可见原先的异常信号降低，硬脊膜增厚略有减轻。图2：该患者头颅MRI。可见侧脑室旁有圆形异常信号。3．2．结果用TSPOTTB检测该患者血液标本，结果阳性（图3）。于是对该患者行诊断性抗痨治疗，方案为四联（异烟肼，利福平，吡嗪酰胺，乙胺丁醇），同时加用甲强龙30mg。治疗3天后，患者体温平，治疗一周后，患者颈部疼痛好转，左上肢肌力逐渐恢复，两周后，患者左上肢肌力基本恢复正常。复查颈部MRI示：原先异常信号减弱，硬脊膜增厚减轻（图1-B）。患者出院时仍维持四联抗痨治疗，激素减为强的松20mg，嘱患者随访。从该病人的治疗反应诊断该患者为结核性脑脊髓膜炎和椎体结核。图3：该病例的ELISPOT结果。其中第一行为阴性对照孔，第二行为阳性对照孔，第三，四行为实验孔。图中可见第3孔中出现大量斑点，为阳性结果。每个斑点代表一个分泌INF-γ的T细胞。用计算机辅助成像技术进行斑点计数得到4个孔的斑点数分别为2，832，401，0。3．3．讨论该患者是肺外结核感染，缺乏典型的结核中毒症状，如消瘦，盗汗等，影像学检查发现颈椎，头颅有异常信号，从形态学上倾向于转移性肿瘤，但对常见肿瘤的筛查未发现原发肿瘤的迹象，脑脊液检查只有蛋白较高，细胞数无明显升高。常见的结核检查，如PPD试验，脑脊液抗酸染色，涂片均为阴性，淋巴结活检也未发现结核感染病灶。在这种情况下，我们用ELISPOT技术对其血液进行检测，结果提示阳性。当然，ELISPOT不是诊断结核的金标准，所以我们不能就此确诊为结核。于是对病人行诊断性抗痨治疗，从抗痨治疗的反应来看，患者症状明显好转，由此判断治疗有效，证实该患者为结核感染诊断成立。目前，临床诊断结核的方法有限。结核菌素试验（TST）是临床常用筛查结核的免疫学方法，虽然操作简单，观察结果方便，但由于其有较高的假阳性和假阴性，对临床结核病的诊断意义不大。细菌学是诊断结核的金标准，但培养需要两个月的时间，而且阳性率取决于采集标本中细菌的数量，不利于早期诊断与治疗。影像学作为辅助诊断方法，对活动性肺结核诊断有一定价值，但对肺外结核诊断存在困难。ELISOPT法作为一种新的酶免疫检测方法在国外（主要是英国与美国）新近刚开始用于结核杆菌感染的检测，它不仅灵敏度高，特异性强[3]，而且操作简单，需时少，一般两天就能看到结果。在国内也已经进入试验性的诊断阶段，但尚缺乏大规模的临床实验及评价。Susan等在一项前瞻性、双盲队列研究中得到ELISPOT的敏感性为83%，显著高于皮试的敏感性63%，同时，非结核病人不会产生假阳性。在小于3岁，合并HIV感染及营养不良的儿童中，皮试的敏感性显著下降，而ELISPOT的敏感性没有显著性改变[4]。另有研究得到ELISPOT在普通人群中的敏感性为96%，在健康人群中的特异性为100%，在HIV阳性患者中的特异性为92%[5]。目前该技术已在国外广泛用于活动性结核病和结核潜伏感染者的诊断，HIV合并结核感染的检测，用于区别结核感染者与BCG接种以及耐药结核菌感染的快速检测。4．总结综上所述，ELISPOT作为一种新的检测结核感染的酶免疫学方法,其敏感性与特异性显著高于传统的TST,而且所需时间少，有利于结核病的早期诊断与治疗意义重大，对隐性结核感染也有诊断价值。但由于价格昂贵,不如TST操作简便易行,限制了该方法在临床的推广与应用。我院首次将该方法试验性的用于辅助临床诊断，并取得一定成效，在临床症状不典型，PPD诊断不明确，涂片及培养均为阴性的疑似结核病患者中，辅以ELISPOT方法，可以帮助确诊结核感染。参考文献[1]侯世芳，许贤豪，刘广志等，酶联免疫斑点（ELISPOT）技术的应用.中国神经免疫学和神经病学杂志，2002;10（9）:200-202.[2]LalbaniA.Spottinglatentinfection:thepathtobettertuberculosiscontrol.Thorax2003;58:916-918[3]PhilipC,RogerH,AnnetteF,etal.Large-scaleevaluationofenzyme-linkedimmunospotassayandskintestfordiagnosisofMycobacteriumtuberculosisinfectectionagainstagradientofexposureintheGambia.ClinInfectDis.2004;38:966-973.[4]LiebeschuetzS,BamberS,EwerK,etal.DiagnosisoftuberculosisinSouthAfricanchildrenwithaT-cell-basedassay:aprospectivecohortstudy.Lancet.2004;364(9452):2196-2203.[5]ChapmanAL,MunkantaM,WilkinsonKA,etal.RapiddetectionofactiveandlatenttuberculosisinfectioninHIV-positiveindividualsbyenumerationofMycobateriumtuberculosis-specificTcells.AIDS.2002,16:2285-2293.