2分子克隆

第二章DNA克隆技术本章，我们讨论4个问题：1.什么是DNA克隆技术——DNA克隆技术的概念。2.为什么能进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的原理和技术路线。3.怎样进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）4.DNA克隆技术的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。DNA重组/基因重组利用酶学方法，将不同来源的DNA分子（目的DNA分子和载体）在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的DNA分子。DNA克隆/基因克隆/分子克隆将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。克隆的含义DNA克隆：分子水平细胞克隆：细胞水平克隆羊：无性繁殖个体水平（一）基因（gene）基因从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。（二）基因工程（geneticengineering）基因工程有目的的通过分子克隆技术，人为操作改造基因，改变生物的遗传性状的系列过程，总称为基因工程。第一节概论一、历史1944肺炎双球菌转化实验证实DNA是遗传物质1953DNA双螺旋模型1960’s遗传密码、中心法则1970反转录酶1946质粒1968-70限制酶1972不同来源的DNA片段体外连接成重组DNA分子1973转化、筛选重组质粒的阳性克隆TheDoubleHelix(1953)ThefoundationofmolecularbiologyFrancisH.CrickJamesD.Watson中心法则二、基因克隆的特点和技术路线技术路线：1分离制备目的DNA片段和载体2目的DNA与载体的剪切3目的DNA与载体的连接4重组DNA分子转化宿主细胞5筛选阳性克隆，大量扩增特点：分子水平操作，细胞水平表达基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达常用的工具酶（toolenzymes）有：1.限制性核酸内切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA连接酶（DNAligase,ligase)3.逆转录酶(reversetranscriptase)4.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)5.核酸酶(nuclease)6.末端转移酶(terminaltransferase)7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。第二节工具酶一、限制性内切酶定义：特异性识别双链DNA并进行切割的酶。内切：在DNA内部切割限制性：识别特异位点切割------GAATTC------------CTTAAG------EcoRⅠ酶切位点命名（1973年Smith原则、Ⅱ型酶）根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写该微生物种名前的2个字母第四个字母大写有变种或品系的第一个字母罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ从一种微生物中发现了几种不同特异性限制酶，按发现顺序排列如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichiacoli）R株分离得到的第一种限制酶。命名酶的来源Haemophilusinfluenzaed属名种名株系酶的名称HindⅠⅡⅢ分类ⅠⅡⅢDNA底物双链DNA双链DNA双链DNA辅因子Mg2+ATPSAMMg2+Mg2+ATP识别序列特异特异特异切割位点非特定特定特定识别序列前后之中之后25bp~27bp100-1000bp修饰作用有无有限制酶的识别位点一般特征（4点）：（1）Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。（2）它能识别DNA的4－6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是4－6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。（3）识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。如：(4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于：①要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列，即1/256②同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。GGATCCCCTAGGBamHⅠ特点Ⅱ型限制酶：识别4-6个核苷酸识别的核苷酸具有回文结构可以形成平末端、粘末端切口概率星号活力星号活力定义：限制酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别的序列类似的序列的现象。影响因素：甘油浓度过高，低离子强度，限制酶用量过大，高PH，有机溶剂污染表示方法：在相应的酶上加星号表示。如：EcoRⅠ（*）如EcoRI切割后产生5′末端突出的粘性末端；5′－G↓AATTC－3′5′－G-OHp-AATTC－3′3′－CTTAA↑G－5′3′－CTTAAG－5′PstI切割后产生3′末端突出的粘性末端：5′－CTGCA↓G－3′5′－CTGCA-OHp-G－3′3′－G↑ACGTC－5′3′－GACGTC－5′还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（bluntend）如SmaI:5′－CCC↓GGG－3′5′－CCCGGG－3′3′－GGG↑CCC－5′3′－GGGCCC－5′Ⅱ型限制酶切口特点1．异源同工酶（Isoschizomers）也称同裂酶:来源不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同：(1)识别顺序与切割方式同，如：MboⅠ和SauSⅠ（－NN↓GATCNN-3′）-NNCTAG↓NN-5′(2)识别顺序同，切割位点不同，如：SmaⅠCCC↓GGG和XmaⅠC↓CCGGG(3)识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰”（甲基化*），另一酶不能。如：HpaⅡ→CCGG和MspⅠ→CCG*GMboⅠ→GATC和Sau3A→GA*TC几种特殊的内切酶2.一个位点包含在另一个位点之中HpaⅡCC↓GGSmaⅠCCC↓GGGSmaⅠ的6个bp含HpaⅡ的4个bp顺序，所以HpaⅡ能识别与切割SmaⅠ的6个bp，但含有HpaⅡ的ccgg的其它6核苷酸顺序不能被SmaⅠ切割。3．同尾酶指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。BamHⅠGGATCCBclⅠTGATCACCTAGGACTAGT二．DNA连接酶1.DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码粘末端连接NAD+供能2.T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码粘末端、平末端连接已知唯一平末端连接酶ATP供能DNA连接酶是基因工程重要的工具酶，常用T4DNAligase.（一）功能：催化有互补顺序的两个DNA分子的粘性末端或平头末端3’－OH、5’－P连接作用。（二）来源－噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。（三）催化反应：需要ATP、Mg2+作辅助因子；对粘性末端催化活性大于平头末端5′－G↓AATTC－3′5′－G－OHp-AATTC－3′3′－CTTAA↑G－5′3′－CTTAA-pOH-G－55′－G－OH。。。p-AATTC－3′3′－CTTAA-p。。。OH-G－5T4DNAligase分子内连接分子间连接三、聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段T4噬菌体DNA聚合酶TaqDNA聚合酶反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）AMVMLV（1）5′→3′DNA聚合酶活性（2）3′→5′外切酶活性（3）5′→3′外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）酶用途：酶活性：（1）cDNA第二条链的合成（2）3’凹陷粘末端的标记，平端化（3）缺口平移法标记DNA探针5’3’DNA聚合酶活性大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ3’5’外切活性5’3’外切活性大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶基因工程很多情况下，E.coliDNApolⅠ可用它的1个大片段Klenow片段酶代替。酶活性：1.5′→3′DNA聚合酶，2.3′→5′外切酶活性。酶用途：(1)补平3’凹陷粘性末端(2)同（1），填平过程中，用32PdNTP标记DNA片段3’末端。(3)cDNA克隆中，用于合成cDNA的第二条链。(4)在Sanger双脱氧法ddNTP系统进行序列分析。1.来源源于T4噬菌体感染的E.coli。2.酶的活性，相似于Klenow片段，但远远强于Klenow片段（1）5ˊ→3ˊ聚合活性（2）3ˊ→5ˊ外切酶活性3.基因工程中用途与Klenow片段一致（标记末端，填平5’末端），不同的是可对3’突出端的DNA分子进行标记。这是用其强劲的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，产生3’凹端。T4噬菌体DNA聚合酶（T4DNApol）反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）催化以RNA为模板反转录生成DNA。最初禽类成髓细胞中分离。主要用于反转录mRNA生成cDNA。RNA指导的DNA合成反应；RNA的水解反应；DNA指导的DNA合成反应。AMV：42℃MLV：37℃①分类②作用③活性反转录酶反转录酶还具有RNaseH活性碱性磷酸酶酶活性：催化核酸的5’端脱磷酸反应酶用途:5’末端标记和防止载体自身连接基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达目的基因与载体Ⅷ因子两端正好有两个酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ，切割后得到1500bp的片段。一、目的基因的获取方法1、染色体DNA的限制性内切酶酶切片段2、通过mRNA反转录合成cDNA逆转录酶AAAATTTTAAAADNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌3、从基因组DNA文库获取目的基因mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制4、从cDNA文库获取目的基因8、最常用的方法：索取5、PCR扩增目的基因6、人工体外合成基因片段7、根据蛋白质序列推导基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达二、载体能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。特性：1复制起点2多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点3筛选标志Amp+Kan+Neo+4分子量不宜过大否则易断裂、转化效率低5表达载体:还要有P、E、前导序列、加尾信号、信号肽、核定位序列等载体的分类分类依据类别克隆扩增或表达举例1.按功能分成（1）克隆载体（2）表达载体√√PBR322PCDN32.按进入受体细胞类型分（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体PUC8PBUDCE41YE3.按载体来源分质粒载体噬菌体载体病毒载体pGEX-4TM13pAdV54.按克隆片段得大小（克隆能力）分(1)1kb(2)10kb(3)22kb(4)50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对，一般3－10kb。常有1-3个抗药性基因，以利于筛选。在子细胞中保持恒定的拷贝数并表达其遗传信息，如抗药性。具有自主复制的能力，但不能独立存活。接受的DNA大小有限，小于15kb.存在于细菌细胞质中双链环状DNA分子大约3～10Kb具有自主复制和转录能力不能独立存活在子细胞中保持恒定的拷贝数并表达其遗传信息特性15kb一般3～10Kb左右接受的DNA片段长度主要用于外源基因的克隆和保存，是一种比较原始的克隆载体。pBR322：B,bacteria;R,Resistance.pBR3223、常用质粒pBR32