纸片法(KB)药敏实验原理及实际操作方法

纸片扩散药敏试验的原理：将含药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。药敏试验根据美国临床标准委员会(NCCLS)推荐的K–B琼脂法进行。本实验通过纸片药敏试验法观察多酸化合物对细菌有无抑制作用，为试管二倍稀释法提供有效基础数据。用无菌棉拭子蘸取已经校正的0.5麦氏比浊浓度的菌液，挤掉多余菌液。用棉拭子涂布整个MH培养基表面，每次将平板旋转60°，涂抹三次，最后沿周边擦绕两圈，以保证菌液涂抹均匀。待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴含药纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴后不可再拿起。每个平板贴5张纸片，纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。在菌接种后15min内贴完纸片。将平板反转，37℃恒温孵育18~24h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，由平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，每个平板各设三个平行组平板，测量抑菌直径时，应取三个平板的平均值为最终结果。抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。每次药敏试验用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923做质控。药敏判读标准根据CLSI标准(2009年)所载受试药对质控菌的抑菌环直径范围作为实验质控标准（判读标准见表5-2）[84]。表5-2纸片扩散法－用质控菌株抑菌环直径(mm)允许范围监测抗菌药物敏感性试验准确性Table5-2Discdiffusiontest－accordingtheadmissiblerangeofquality-controlstrain’sinhibitionzonediametertomonitortheaccuracyofantibioticssusceptibilitytest(mm)抗菌药物纸片含药量（µg）抑菌环直径(mm)SIR大肠埃希菌ATCC25922金黄色葡萄球菌ATCC25923KF30≥1815–17≤1416–2227–35AMP10≥1714–16≤1328–3527–28CIP5≥2116–20≤1530–4022–30NOR5≥1713–16≤1215–2129–37KF:头孢噻吩；AMP:氨苄西林；CIP:环丙沙星；NOR:诺氟沙星；S:敏感；I:中介；R:耐药