GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验

中华人民共和国国家标准GB4789.10—2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.10—2016Ⅰ前言本标准代替GB4789.10—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》、SN/T0172—2010《进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法》、SN/T2154—2008《进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术》。本标准与GB4789.10—2010相比,主要变化如下:———试验用增菌液统一为7.5%氯化钠肉汤。GB4789.10—20161食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验1范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的检验方法。本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品中金黄色葡萄球菌的计数。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36℃±1℃。2.2冰箱:2℃~5℃。2.3恒温水浴箱:36℃~56℃。2.4天平:感量0.1g。2.5均质器。2.6振荡器。2.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。2.8无菌锥形瓶:容量100mL、500mL。2.9无菌培养皿:直径90mm。2.10涂布棒。2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。3培养基和试剂3.17.5%氯化钠肉汤:见A.1。3.2血琼脂平板:见A.2。3.3Baird-Parker琼脂平板:见A.3。3.4脑心浸出液肉汤(BHI):见A.4。3.5兔血浆:见A.5。3.6稀释液:磷酸盐缓冲液:见A.6。3.7营养琼脂小斜面:见A.7。3.8革兰氏染色液:见A.8。3.9无菌生理盐水:见A.9。第一法金黄色葡萄球菌定性检验4检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。GB4789.10—20162图1金黄色葡萄球菌检验程序5操作步骤5.1样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min。若样品为液态,吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀。5.2增菌将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h~24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。5.3分离将增菌后的培养物,分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板,血平板36℃±1℃培养18h~24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养24h~48h。5.4初步鉴定金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm~3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白GB4789.10—20163色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。5.5确证鉴定5.5.1染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5μm~1μm。5.5.2血浆凝固酶试验:挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面,36℃±1℃培养18h~24h。取新鲜配制兔血浆0.5mL,放入小试管中,再加入BHI培养物0.2mL~0.3mL,振荡摇匀,置36℃±1℃温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI,36℃±1℃培养18h~48h,重复试验。5.6葡萄球菌肠毒素的检验(选做)可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录B检测葡萄球菌肠毒素。6结果与报告6.1结果判定:符合5.4、5.5,可判定为金黄色葡萄球菌。6.2结果报告:在25g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。第二法金黄色葡萄球菌平板计数法7检验程序金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序见图2。图2金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序GB4789.10—201648操作步骤8.1样品的稀释8.1.1固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。8.1.2液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。8.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。8.1.4按8.1.3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管或吸头。8.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加入三块Baird-Parker平板,然后用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如Baird-Parker平板表面有水珠,可放在25℃~50℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。8.3培养在通常情况下,涂布后,将平板静置10min,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1h;等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于36℃±1℃培养24h~48h。8.4典型菌落计数和确认8.4.1金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm~3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。8.4.2选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU~200CFU之间的平板,计数典型菌落数。8.4.3从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验。分别做染色镜检,血浆凝固酶试验(见5.5);同时划线接种到血平板36℃±1℃培养18h~24h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。9结果计算9.1若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU~200CFU之间,计数该稀释度平板上的典型菌GB4789.10—20165落,按式(1)计算。9.2若最低稀释度平板的典型菌落数小于20CFU,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。9.3若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU,但下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。9.4若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU,而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20CFU~200CFU范围内,应计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。9.5若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20CFU~200CFU之间,按式(2)计算。9.6计算公式式(1):T=ABCd…………………………(1)式中:T———样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A———某一稀释度典型菌落的总数;B———某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;C———某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;d———稀释因子。式(2):T=A1B1/C1+A2B2/C21.1d………………………(2)式中:T———样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A1———第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B1———第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C1———第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;A2———第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B2———第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C2———第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;1.1———计算系数;d———稀释因子(第一稀释度)。10报告根据9中公式计算结果,报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌数,以CFU/g(mL)表示;如T值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。第三法金黄色葡萄球菌MPN计数11检验程序金黄色葡萄球菌MPN计数检验程序见图3。GB4789.10—20166图3金黄色葡萄球菌MPN法检验程序12操作步骤12.1样品的稀释按8.1进行。12.2接种和培养12.2.1根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种1mL样品匀液至7.5%氯化钠肉汤管(如接种量超过1mL,则用双料7.5%氯化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物36℃±1℃培养,18h~24h。12.2.2用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于Baird-Parker平板36℃±1℃培养,24h~48h。12.3典型菌落确认按8.4.1、8.4.3进行。13结果与报告根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数,查MPN检索表(见附录C),报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数,以MPN/g(mL)表示。GB4789.10—20167附录A培养基和试剂A.17.5%氯化钠肉汤A.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠75g蒸馏水1000mLA.1.2制法将上述成分加热溶解,调节pH至7.4±0.2,分装,每瓶225mL,121℃高压灭菌15min。A.2血琼脂平板A.2.1成分豆粉琼脂(pH7.5±0.2)100mL脱纤维羊血(或兔血)5mL~10mLA.2.2制法加热溶化琼脂,冷却至50℃,以无菌操作加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板。A.3Baird-Parker琼脂平板A.3.1成分胰蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母膏1.0g丙酮酸钠10.0g甘氨酸12.0g氯化锂(LiCl·6H2O)5.0g琼脂20.0g蒸馏水950mLA.3.2增菌剂的配法30%卵黄盐水50mL与通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液10mL混合,保存于冰箱内。GB4789.10—20168A.3.3制法将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,调节pH至7.0±0.2。分装每瓶95mL,121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂,冷至50℃,每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。A.4脑心浸出液肉汤(BHI)A.4.1成分胰蛋白质胨1