新发突发传染病病原体的鉴定

新发突发传染病病原体的新发突发传染病病原体的诊断技术诊断技术上海市（复旦大学附属）公共卫生中心上海市（复旦大学附属）公共卫生中心应急检测实验室应急检测实验室胡芸文胡芸文FriendorFoe?RotavirusEbolavirusBacteriumAlgaeProtozoanVirus1973年以来部分新发的传染病zz19731973轮状病毒轮状病毒婴儿腹泻的主要病因婴儿腹泻的主要病因zz19751975细小病毒细小病毒81958195号病，慢性溶血性贫血的再障危象号病，慢性溶血性贫血的再障危象zz19761976隐孢子虫隐孢子虫隐孢子虫病，急性小肠结肠炎隐孢子虫病，急性小肠结肠炎zz19771977埃博拉病毒埃博拉病毒埃博拉出血热埃博拉出血热zz19771977嗜肺军团菌嗜肺军团菌军团病军团病zz19771977汉坦病毒汉坦病毒肾综合征出血热肾综合征出血热zz19771977空肠弯曲杆菌空肠弯曲杆菌空肠弯曲菌肠炎空肠弯曲菌肠炎zz19771977丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒丁型肝炎丁型肝炎zz19801980嗜人嗜人TT细胞病毒细胞病毒II型型TT细胞淋巴瘤／白血病细胞淋巴瘤／白血病zz19811981金黄色葡萄球菌产毒株金黄色葡萄球菌产毒株中毒性休克综合征中毒性休克综合征zz19821982大肠埃希菌大肠埃希菌O157O157：：H7H7出血性结肠炎出血性结肠炎zz19821982嗜人嗜人TT细胞病毒细胞病毒1111型型毛细胞白血病毛细胞白血病zz19821982伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体莱姆病莱姆病zz19831983人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒艾滋病艾滋病(HIV)(HIV)19731973年以来部分新发的传染病年以来部分新发的传染病((续续))19831983幽门螺杆菌幽门螺杆菌消化性溃疡病消化性溃疡病19861986环孢子球虫环孢子球虫环型孢子虫病环型孢子虫病((顽固性腹泻顽固性腹泻))19881988人疱疹病毒人疱疹病毒66型型突发性玫瑰疹突发性玫瑰疹19891989丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒丙型肝炎丙型肝炎19901990戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒戊型肝炎戊型肝炎1992013919920139霍乱弧菌霍乱弧菌O139O139霍乱霍乱19921992巴尔道氏体巴尔道氏体猫抓病，杆菌性血管瘤病猫抓病，杆菌性血管瘤病19931993汉坦病毒分离株汉坦病毒分离株汉坦病毒肺综合征汉坦病毒肺综合征19941994SabiaSabia病毒病毒巴西出血热巴西出血热19941994新变异型克雅氏病新变异型克雅氏病((人类疯牛病人类疯牛病)1985)1985年疯牛病（牛海绵状脑炎年疯牛病（牛海绵状脑炎BSEBSE））----19941994年出现首例年出现首例nvCJDnvCJD----19961996年提出年提出nvCJDnvCJD概念概念病原为朊蛋白病原为朊蛋白PrPPrP（英）（英）19951995庚型肝炎病毒庚型肝炎病毒庚型肝炎庚型肝炎1997H5N11997H5N1禽流感病毒禽流感病毒人禽流感人禽流感19981998NipahNipah病毒病毒尼巴病毒性脑炎尼巴病毒性脑炎19991999西尼罗病毒西尼罗病毒西尼罗病毒性脑炎西尼罗病毒性脑炎20002000裂谷热裂谷热(RiftValley)(RiftValley)病毒病毒裂谷热裂谷热2003SARS2003SARS冠状病毒冠状病毒SARSSARS（传染性非典型肺炎）（传染性非典型肺炎）z大部分人类致命性疾病均是由动物传播，包括现正肆虐全球的禽流感。z每年至少有一种新病原体，包括病毒、细菌、寄生虫、原生动物和真菌等从动物传染给人类。z前所未有的速度产生突变，并传给人类，就如艾滋病、马尔堡出血热、SARS以及现正肆虐全球的禽流感等难抗病毒。z研究人员分辨1407种令人类生病的病原体，发现其中至少800种越过种物界线，由动物传至人类。新发传染病－－动物传播与人类行为及环境的改变有关z过去25年来曾出现38种新病原体袭击人类，其中四分三为源自动物的疾病，包括艾滋病、马尔堡出血热、SARS及禽流感等。z丛林打猎、密集耕种、全球变暖及长途旅行的普及，增加疾病跨种物传播的机会，使动物身体上的病原体容易产生突变，感染人类。z一个典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴身上发现的一种病毒，其后传播至人类身上，更演变成世纪绝症。新病原体的特征z现时人类新传染病的病原体，多属于核糖核酸(RNA)病毒类，包括艾滋病毒及流感病毒，可于短时间内发生突变，并容易适应新宿主，令跨种物传播机会变得更大。人类与传染病较量中的四方面重大突破隔离检疫制度的建立;病原微生物的发现;特效药物的出现;疫苗的诞生.快速诊断是关键快速诊断是关键zz在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和预防是三个关键环节。其中，及时正确诊预防是三个关键环节。其中，及时正确诊断最为关键，是有效治疗的基础，也是制断最为关键，是有效治疗的基础，也是制定预防策略的依据。定预防策略的依据。zz及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预警，这是现代传染病防治体系的最前沿警，这是现代传染病防治体系的最前沿对已知传染病要尽快明确诊断对已知传染病要尽快明确诊断对未知新发传染病要查病因对未知新发传染病要查病因传染病的实验室传染病的实验室诊断诊断„„一般检查一般检查;;„„生化检查生化检查;;„„病原学检查病原学检查;;„„免疫学检查免疫学检查;;„„病理组织检查病理组织检查;;„„影像学检查影像学检查..传统的和常规的病原学传统的和常规的病原学诊断诊断zz分离培养分离培养((细胞细胞,,组织动物组织动物););zz显微镜检查显微镜检查((光学和电子显微镜光学和电子显微镜););zz抗原成分检测抗原成分检测(ELISA,(ELISA,免疫荧光等免疫荧光等););zz分子生物学基因诊断分子生物学基因诊断((核酸杂交核酸杂交,PCR,PCR等等););ElectronmicrographsElectronmicrographsAdenovirusRotavirus(courtesyofLindaStannard,UniversityofCapeTown,S.A.)免疫荧光检测免疫荧光检测Positiveimmunofluorescencetestforrabiesvirusantigen.(Source:CDC)(VirologyLaboratory,Yale-NewHavenHospital)细胞病变效应细胞病变效应(cpe)(cpe)zzSomeviruseskilltheSomeviruseskillthecellsinwhichtheycellsinwhichtheyreplicate,ofteneasilyreplicate,ofteneasilyvisibleascpe,othervisibleascpe,othervirusesproducelittlevirusesproducelittleornocpeornocpezzTypicallyroundingorTypicallyroundingordetachingofcellsanddetachingofcellsandcellfusion(syncytia)cellfusion(syncytia)FromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpressFromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress实实验验动动物物LaboratoryanimalsLaboratoryanimals--animalmodelsofhumaninfection.animalmodelsofhumaninfection.HistoricallytheonlywaytostudyviruseswasfromanimaltoHistoricallytheonlywaytostudyviruseswasfromanimaltoanimal.animal.zzProblemsProblems--1)inconvenientandexpensive,2)notadefined1)inconvenientandexpensive,2)notadefinedsystemsystem--leadstogenerationofvirusmutants,3)animalwelfareleadstogenerationofvirusmutants,3)animalwelfareissues,issues,zzAdvantagesAdvantages--1)somevirusescanonlybestudiedinthisway,2)1)somevirusescanonlybestudiedinthisway,2)givesuniqueinsightintoviruspathogenesisgivesuniqueinsightintoviruspathogenesiszzEmbryonatedeggsEmbryonatedeggsFromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress核酸诊断的发展史核酸诊断的发展史zz核酸分子杂交核酸分子杂交zz聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR））zz核酸定量分析核酸定量分析核酸的直接检测核酸的直接检测核酸扩增检测核酸扩增检测(PCR)(PCR)定性定性PCRPCR定量定量PCRPCR核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleicacid(nucleicacidmoleculamoleculahybridization)hybridization)genomeprobe32P35S3H125I生物素地高辛酶genomegenomegenomeprobeprobeprobe检测方法：放射自显影底物显色化学发光常用核酸分子杂交技术常用核酸分子杂交技术斑点杂交（spotblothybridization)凝胶电泳印迹转移杂交（Southernblothybridization)原位杂交（in-situhybridization)聚合酶链反应（PCR）基本步骤和原理变性（高温）退火（低温）延伸（适温）每一循环模板引物引物dATPdGTPdTTPdCTPTaq酶PCR原理和步骤定量定量PCRPCR------荧光实时定量荧光实时定量PCRPCRzzTaqmanTaqman水解探针法水解探针法z杂交双探针法z分子信标（环性探针）法zAmplisensor能量转换法等新发传染病的病原体？？？新发传染病的病原体？？？病原学发现的“科赫三定律”一、每种传染病必定能发现其病原体；一、每种传染病必定能发现其病原体；二、能培养出该病原体的纯种；二、能培养出该病原体的纯种；三、以培养出的纯种病原体接种于动物可以三、以培养出的纯种病原体接种于动物可以产生相同的病变。产生相同的病变。建立该病原体的鉴定方法动物试验临床实验室诊断流行病学研究等分离到该病原体确定一种疾病病原体的基本步骤最终确定病原体与疾病的病因学关系基本思路基本思路回答两个问题：回答两个问题：zz是否是已知的病原体或其变种？是否是已知的病原体或其变种？zz是否是完全未知的一种病原体？是否是完全未知的一种病原体？基本要求：快、准基本要求：快、准已知病原体的快速诊断已知病原体的快速诊断高通量的检测技术高通量的检测技术高通量的病原体筛选技术高通量的病原体筛选技术病原体核酸的高通量检测病原体核酸的高通量检测技术一：多重技术一：多重PCRPCR（联用技术：质谱技术、（联用技术：质谱技术、液相芯片技术）液相芯片技术）技术二：病原体基因芯片技术二：病原体基因芯片病原体抗原或抗体的高通量检测病原体抗原或抗体的高通量检测核心技术：蛋白质芯片核心技术：蛋白质芯片MultiplexPCR-MassTagsystem多重PCR-质谱联用技术美国哥伦比亚大学Lipkin研究组发明了一种基于multiplexPCR-MassTa