您好,欢迎访问三七文档
当前位置:首页 > 行业资料 > 国内外标准规范 > CCK-8中文说明书
CCK-8在避光0-5℃的条件下可以存放1年,在-20℃条件下可以贮藏更久。反复解冻和冷冻会增加背景值,干扰实验测定。如需经常使用请将试剂存放在0-5℃的条件下。贮藏条件5.加CCK-8试剂时速度要快,减少试剂在移液器上的残留。为使CCK-8试剂和培养基充分混匀,建议在加入CCK-8试剂后轻轻振摇培养板。为了避免加样时由于CCK-8试剂在枪头上的残留所带来的误差,可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。6.CCK-8试剂中的WST®-8会与还原剂反应生成WST®-8甲臜,如果实验中有还原剂,请检查背景的O.D值,即在不含细胞的培养基中加入药物,然后加入CCK-8试剂在一定时间内检测,和不加药物的培养基进行比较(只加CCK-8试剂),如果O.D值明显偏高,则说明有反应。7.若细胞培养时间较长,培养基颜色发生变化或pH发生变化,建议更换新鲜的培养基后再加CCK-8试剂。含有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。8.如果样品为高浑浊度的细胞悬液,建议设定600nm(或600nm以上)作为参比波长,扣除参比波长的O.D值即可。9.CCK-8试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深,O.D值不断增加(注:活细胞内的脱氢酶是持续产生的)。另外,其他的实验,例如中性红法或结晶紫法,也可在CCK-8法检测完后继续进行。10.如果要测定细胞的具体数量,建议先做一个标准曲线(具体方法参见P.3页的“制作标准曲线”)。1.第一次做实验时,建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。2.接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发,为了减少误差,建议培养板的四边每孔只加培养基,而不作为指标检测孔。3.培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下,白细胞较难显色,因此需要较长的CCK-8反应时间或增加细胞数量(~105个细胞/孔)。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞,在加入CCK-8培养1-4小时后,可先从培养箱中取出,目测染色程度或用酶标仪测定决定。若显色困难,可将培养板放回培养箱,继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞,CCK-8的培养时间一般为1-4小时,但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度(根据细胞种类而定,需要摸索一下条件)。注意:CCK-8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。4.有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加CCK-8试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加,容易产生气泡,会干扰O.D值读数。12345678910细胞增殖-毒性检测试剂盒——细胞增殖实验和细胞毒性实验(100孔,500孔,1,000孔,3,000孔以及10,000孔的规格)请在使用前仔细阅读本说明书CellCountingKit-8(CCK-8)注意事项:-100孔:1mlx1管-500孔:5mlx1瓶-1,000孔:5mlx2瓶-3,000孔:5mlx6瓶-10,000孔:100mlx1瓶试剂内含10ml、100-200ml以及多通道移液器带有450nm滤光片的酶标仪96孔培养板CO2培养箱所需设备和材料:r=0.99600.10.20.30123HL60Cellr=0.99900.511.500.511.52[3H]-Thymidinex10-5dpm[3H]-Thymidinex10-5dpmHeLaCellNumberofCells(x103cells/well)NumberofCells(x103cells/well)01230510152025HeLaCell00.10.20.30510152025HL60Cell图.1:WST®-8和WST®-8甲臜的结构NNNNNNNHN-O3S-O3SNO2NO2NO2NO2SO3-SO3-H3COH3CONa++formazanWST®-8+NNADHNAD+NWST®-8formazansubstratesdehydrogenasescellNADNADHelectronmediatorreducedformelectronmediatorcolorlessWST®-8orangecolor图.2:CCK-8细胞活性检测的原理图.3:CCK-8法与[3H]-thymidine掺入法之间的相关性图.4:使用CCK-8与其他试剂灵敏度的比较CellCountingKit-8(CCK-8)利用了Dojindo开发的水溶性四唑盐—WST®-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),它在电子载体1-MethoxyPMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料,如图.1所示。*专利号:WO97/38985概述CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中;不需要预配各种成分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度,无放射性的比色检测法。WST®-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中(如图.2所示),生成的甲臜量与活细胞数量成正比。1.Ahighlywater-solubledisulfonatedtetrazoliumsaltasachromogenicindicatorforNADHaswellascellviability,Talanta,44,1299-1305,19972.SMYD3encodesahistonemethyltransferaseinvolvedintheproliferationofcancercells,NatureCellBiology,6,731-740,01Aug20043.AVitalRoleforApe1/Ref1ProteininRepairingSpontaneousDNADamageinHumanCells,MolecularCell,17,463-470,20054.Cannabinoidspromoteembryonicandadulthippocampusneurogenesisandproduceanxiolytic-andantidepressant-likeeffects,J.Clin.Invest.,115:3104-3116,Nov20055.Involvementofautophagyintrypsinogenactivationwithinthepancreaticacinarcells,J.CellBiol.,Vol.181,No.7,10651072,2008参考资料细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100ml/孔)。将培养板放在培养箱预培养(在37℃,5%CO2的条件下)。2.向每孔加入10ml的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响O.D值的读数)。3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。4.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。5.如果暂时不测定O.D值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。细胞增殖-毒性检测1.在96孔板中配制100ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃,5%CO2的条件下)。2.向培养板加入10ml不同浓度的待测物质。3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6,12,24或48小时)。4.向每孔加入10mlCCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响O.D值的读数)。5.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。7.如果暂时不测定O.D值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8之前更换新鲜培养基,去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。图.5:使用CCK-8做毒性实验02550751000.0000010.00010.011ConcentrationofToxicant(mmol/l)MMCSDSDodecylsulfate,sodiumsalt(SDS)mitommycin-C(MMC)CH3(CH2)11-OSO3NaNH2H2NH2NOOOONHNO-CH3制作标准曲线1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。2.按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。3.接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),O.D值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间)。操作说明参考资料6.AML1-ETOandC-KITmutation/overexpressionint(8;21)leukemia:ImplicationinstepwiseleemogenesisandresponsetoGleevec,PNAS,vol.102,no.4,1104-1109,January25,20057.NegativeRegulationofHepatocellularCarcinomaCellGrowthbySignalRegulatoryProteinα1,HEPATOLOGY,vol.40,no.3,618-628,20048.采用可溶性噻唑盐WST-8检测细胞病变,中国生物制品学杂志,Vol.17,405-407,20049.MTT法和CCK-8法检测细胞活性之测试条件比较,激光生物学报,Vol.16,559-562,200710.可溶性噻唑盐WST®-8用于重组人白细胞介素-2的生物学活性测定,微生物学免疫学进展,Vol.33,31-34,200511.MTT法和CCK-8法检测悬浮细胞增殖的比较,军事医学科学院院刊,Vol.33,400-封3,200912.NF-kBp65在高糖诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用,细胞生物学杂志,Vol.29,875-879,2007Q&A:如果您需要更多的信息或者有任何问题可以通过以下的方式联系我们:上海上海市零陵路899号飞洲国际广场27楼J座邮编:200030电话:800-988-0083网址:@dojindo.cn北京北京市朝阳区德外马甸裕民路12号元辰鑫大厦E1-210室邮编:100029电话:010-8225-1765网址:@dojindo.cn1.每孔应该接种多少细胞?贴壁细胞每孔至少需要接种1,000个细胞(100ml的培养基),检测白细胞时由于它的灵敏度较低,每孔至少需要接种2,500个细胞(100ml的培养基),建议先做几个孔摸索接种细胞的数量。如果要使用24孔板或是6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。2.如何设定空白对照?在不含细胞的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度作为空白对照。3.哪些物质会影响CCK-8的测定?当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定,增加O.D值;在有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生,减小O.D值;在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白
本文标题:CCK-8中文说明书
链接地址:https://www.777doc.com/doc-6977939 .html