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生物通2008技术点评:磁式细胞分选在20世纪70年代末期到80年代初,许多分离细胞的技术不断涌现出来。1978年,Guesdon等用聚丙烯酰胺琼脂糖磁珠来简单快速地分离不同的血清蛋白。没过多久,这项技术就开始应用在分离完整的细胞上了。1982年,Langenaur和Schachner在磁珠上包被了少突胶质细胞表面抗原的单克隆抗体。通过这种磁珠,他们从混合的细胞群体(少突胶质细胞约占1.5%)中富集目的细胞,结果纯度达到91%。由于磁式分选技术中,吸附和解离靶标的条件仅仅需要外加磁场和撤离磁场这种极为简单的物理方法来实现,无需添加任何其他试剂或者操作步骤,也不需要太多时间,磁场力对待分离样品的损伤小到可以忽略不计,因此,磁式分选技术很快得到了广泛应用,免疫磁珠也从抗体偶联磁珠发展到生物素磁珠,二抗磁珠,OligodT磁珠等各类纯化介质偶联磁珠,常用于分离核酸、蛋白及细胞。这项技术的适应性及速度使它也成为高通量分析的理想选择。例如,日渐广泛的高通量核酸分离系统有相当多种试剂盒采用了磁式分选技术。磁式细胞分选原理磁式细胞分选的基本原理是借助偶联在磁性微粒上抗体高特异性识别并标记目标细胞表面抗原,再让混有磁珠的细胞悬液通过磁场,结合了磁珠的细胞被吸附在磁场侧壁上,而未结合的细胞被除去,得到纯化的目标细胞,从而实现高效的分选和富集。磁式分选高效快速,可在2-30分钟内实现105到1011个细胞分选。由于其原理主要借助抗体抗原识别,通常又称为免疫磁珠法。磁式细胞分选可手动完成,简单快速,不需要特别昂贵的设备,对实验和技术要求较低,实验流程对细胞损伤小,无菌和细胞状态更有保证,分选得到的细胞可进行培养、血液回输或者流式分析。磁式细胞分选系统可以分离出非常纯的细胞群体,而且有极好的回收率和存活率。依据细胞频率和标记表达水平的不同,纯度可达99%,回收率90%。但是磁式细胞分选仅能作为细胞分选之用,不能进行细胞分析,且分选过程中难以去除死细胞的干扰,难于同时进行多种标志物的分选。磁式细胞分选已经成为分离造血干细胞、祖细胞、抗原特异性T或B细胞,分离残留的肿瘤细胞等的重要工具,还可以根据细胞的胞浆蛋白或活性细胞的分泌蛋白来进行细胞分离。磁式细胞分选还可以作为流式分选前样品处理步骤。磁式细胞分选产品比较著名的品牌包括德国美天旎(MACS),Invitrogen旗下Dynal,BD公司,StemCell公司,R&D公司等等,生物通在此为大家逐一介绍。基础设备:磁珠磁式分选的主要工具包括磁珠,磁力架,分离柱或者分离试管。磁珠顾名思义,就是有磁性的微球。磁式分选的原理在于利用磁珠在磁场中的磁力作用,将磁珠标记的细胞和其他未标记细胞分离,因此磁珠标记的质量是磁式分选的关键。页,共19页下一页返回由于专利等因素,每家公司提供的磁珠大小各异,设计侧重点也不同。德国美天旎(MACS)磁珠由多聚糖和氧化铁组成的超顺磁化微粒,无毒性,微珠直径约有50nm,比细胞小200多倍,体积为细胞的百万分之一,可与病毒的大小相比,光学显微镜下不可见,标记细胞上的MACS磁珠即使在扫描电镜照片上也几乎看不到。由于磁珠微粒极小,对细胞无机械性压力,不损伤细胞;可被细胞生物降解而无需解离磁珠,且不会激活细胞或影响细胞的功能和活力,细胞的生理功能也不变。因为极其微小,同样体积的磁珠密度更大,使得孵育时间短,标记反应只要几分钟;MACS磁珠在细胞表面的标记比例高,令标记的目标细胞在磁场中信号更强,这一点对于样品丰度极小的痕量细胞(10-8)分选尤为有利,使得极少数细胞也能达到很好的分离识别效果。磁性标记只占用20-30%的结合位点,不影响细胞的荧光抗体标记,与流式细胞仪兼容,亚微观的MACS磁珠不会影响被标记细胞的光散射特性.经MACS分选的细胞可直接进行后续实验:如流式细胞仪分析或分选、分子生物学研究、细胞培养、回输给人或者动物,也可与荧光显微镜术,PCR或FISH兼容。磁式分离技术的始祖是Invitrogen旗下Dynal公司的Dynabeads系统。Dynabeads是由氧化铁磁性材料合成的均一、超顺磁微球。它的特点是在氧化铁外包被了一层多聚材料,使细胞不接触氧化铁或葡聚糖,不会引起细胞毒性或免疫原性。而且Dynabeads的大小、性状和表面积的均一性很好(CV3%),提供了最佳反应动力学,促进了快速、高效的结合。大小有三种,直径分别为4.5um、2.8um和1um,适用于细胞分选和活化、生化实验及体外诊断。Dynabeads的大小和细胞相近,在阳性选择后如果要上流式或其他分析,就需要多一步反应:解离磁珠。也正是因为大小和细胞相似,可以作为人工抗原表达表达细胞来模仿体内细胞信号,从而活化人和小鼠T细胞。BD的IMag磁珠大小介于MACS磁珠和Dynabeads之间,直径约为200nm。IMag磁珠也是超顺磁颗粒,包被了BDPharmingen生产的高质量单抗或链酶亲和素,适用于BDIMagnet磁力架和普通的试管。它对细胞温和,不影响细胞功能,分离后可继续培养或进行流式分析。StemCell的磁珠则分为两种:EasySep适用于管式分选系统,是流式兼容的;StemSep则适用于柱式的磁性分选系统。R&D公司则提供了链酶亲和素结合的磁珠,直径约为150nm,有点像胶体颗粒。细胞先与生物素标记的一抗特异结合,磁珠再与生物素结合,从而实现分离。分选柱在德国美天旎MACS系统中,分离过程是在分选柱(column)中进行的。MACS分选柱是一类填充有不同规格铁磁珠的塑料容器,其表面覆盖无损细胞的柔性亲水包被,因此不会损伤细胞。在磁场外MACS分选柱没有磁性,但是当置于MACS分选永磁铁的磁场中时,分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍,足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞;磁性标记细胞从分选柱中通过时受到均匀的磁力作用,可在磁场中悬浮,既不沉淀又不凝聚,未标记的细胞则在重力作用下自动流出柱子,直接加缓冲液即可清洗掉残留的未标记细胞,最后分选柱撤离磁场即可得到靶细胞,无需重复倒上清,操作方便。由于分选柱是一边流入一边流出,即使样品体积超过2008年7月28日第三十四期第2页,共19页下一页返回柱容积也可以连续操作,无需分管分次进行,对于样品中低丰度细胞的分离非常有利。MACS分选柱特别设计减缓样本过柱的流速,缩小分选柱直径以延长过柱长度,吸附更彻底,清洗过程不需撤离磁场,直接加缓冲液冲洗即可,柱式设计可实现类似层析柱式的逐级分离的效果,清洗更彻底。有效提高分选纯度和回收率。大多数MACS分选柱都是无菌包装,一次性使用,可以满足细胞培养所需的无菌条件。效果好的代价是成本高。特制的分选柱使得MACS使用成本一下提高很多。除去初次购买套装有赠送分选柱外,MACS的分选柱相当不便宜,更有甚者,还分有很多种,比如有不同尺寸,不同大小还有分正选和负选专用的柱子等等。其他厂家则不需要这种特定的柱子,使用试管分离(tube-based),普通的eppendorf离心管或者5ml或15ml离心管即可,可以减少分离时外源免疫原性物质对结果的影响,是经济实惠之选,但是操作上需要稍微麻烦一点----将试管套入相应的磁力架上,磁珠标记细胞被吸附在管壁或者管底,然后倒掉或吸出上清。清洗需要重复这几个步骤。磁力架/磁式分选器简单的说,磁力架或者分选器就是为磁珠标记细胞提供分离磁场的一块永磁铁。但是当然不会是满大街磁铁笔盒似的廉价磁铁块,看起来总归是要高科技一些,虽然本质是一回事儿。美天旎管他叫分选器(separator),分选器在使用时通常是吸附在特制铁架的垂直面上,可根据分离柱和下面回收管高度随意调整位置,为求磁场强度最大化而设计为270度紧贴包围廋长的分离柱身,前方仅留平行出口便于平行取出分选柱;上端可承托分选柱的漏斗式大开口。分选器从小到大,从手动的µMACS,MiniMACS(OctoMACS,就是8联MiniMACS),MidiMACS(QuadroMACS,即4联MidiMACS),VarioMACS,SuperMACS,到全自动AutoMASC,临床的CliniMACS,应有尽有,须得配合不同的分离柱使用。使用常规离心管作为分选容器的产品,其分选磁力架则是配合离心管设计,兼容尖底和圆底离心管,样本量大时用于垂直位置,尖底离心管可用倾斜位置,适于处理少量样本。Dynal用于细胞分离的磁力架有两种:DynaMag-15和DynaMag-50。DynaMag-15(如下图)的设计很巧妙,是二合一的磁力架。它既可以装4个标准的15ml管,也可以翻转180度后装4个用于流式的5ml管。DynaMag-50可以装2个5-50ml管。BDImagnet是钕铁硼永磁体,能装配6根12×75mm的BDFalcon™检测试管(货号352008)或者2根17×100mm检测管(货号352057)。分离细胞的回收率(95%)和纯度(95%)均与一次性分离柱相当,页,共19页下一页返回但更为经济。R&D的磁力架MagCellectMagnet与BDImagnet有些类似,也可以容纳6个12×75mm(5ml)或2个17×100mm(15ml)圆底管。这个磁力架适用于100nm或更大的磁珠,可以进行正选或负选。StemCell公司的RoboSep是一台全自动的磁式细胞分选系统。其原理是以不需分离柱的EasySep细胞正选和负选系统为基础,自动完成每次四种样品的细胞分选。仪器的操作在彩色的触感屏上完成,每种细胞的最佳分选程序可以事先被设定,使用时被调出即可。使用时只需要将样品和需要的分选试剂放入RoboSep分选系统中,RoboSep即可在1小时内自动完成细胞分选的全过程。RoboSep使用一次性枪头完成加样和加试剂的全过程,完全避免交叉污染,分选过程结束后,细胞即可被用于各种下游实验。RoboSep可以被放在超净台或生物安全柜中操作,以保证整个过程在无菌状态下完成。正选时,同时可以分选四种不同的样品,每种样品的细胞数最多为2X109细胞;负选时可同时分选两种不同的样品,每种样品的细胞数最多为1X109细胞。正选和负选同时进行,对一种样品进行负选,对另外两种样品进行正选。分离策略磁式细胞分离基本策略有两种:阳性选择(正选)和阴性选择(负选)。如果简单的正选或者负选不能达到目的,还可以将这两种方法组合搭配进行复合选择。阳性选择是指根据靶细胞表面特异抗原,用相应的抗体磁珠标记靶细胞,磁性分选去除其他细胞后,得到纯化的标记靶细胞。多数情况下,阳性选择都是首选,因为操作简单,速度快,特异性高,回收率高。想要保留目标细胞特定抗原处于未结合的“untouched”状态时(未激活状态),就可以用阴性选择,也称之为去除法,即标记其他非目的细胞,令其滞留磁场,然后洗脱得到未标记的纯化靶细胞。例如用半抗原对血液中CD4,CD11b,CD16,CD19,CD36,和CD56进行修饰和半抗原抗体磁珠标记,通过负选可洗脱未被标记修饰的CD8+_细胞,得到未激活的CD8+_细胞,用于研究无细胞表面分子无交联而引起效应的功能研究,如CD8+T细胞激活的信号要求,诱导细胞毒性T细胞增值或者无能,表达调控等方面研究。简单的正选,如果是MACS一类的超微磁珠,由于磁珠成分可被细胞生物降解,因而则可以直接进入下一步培养或者分析,如果是大磁珠则需要先解离磁珠才能得到靶细胞。但是如果单纯的正选或者负选还不能达到目的时,则需要组合多次正选或者负选以达到目标。正如生物通前面提到过,磁式分选难于同时做多个标记物指标的分选,但巧妙使用复合选择法有时一样可以达到目标。例如,造血干细胞/祖细胞分离中必然用到CD34,可以用CD34抗体磁珠直接标记得到CD34+的细胞,然后再选择其他标记物进2008年7月28日第三十四期第4页,共19页下一页返回行进一步分选。这时两次分离之间无论磁珠大小都需要先解离磁珠后才能进行下一步磁式分离的工作。例如,血液中髓细胞源树突细胞主要群体CD11chi
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