分子生物学常用技术

分子生物学常用技术第十七章分子生物学常用技术凝胶电泳分子杂交聚合酶链反应(PCR)技术DNA的物理图谱DNA序列测定基因芯片第一节凝胶电泳(gelelectrophoresis)电泳概念基本原理Qμ＝6πrημ:迁移率Q:电荷量r:粒子半径（分子量）η:介质粘度电泳的用途–分离–鉴定纯度–测定分子量凝胶电泳的种类–琼脂糖凝胶电泳–聚丙烯酰胺凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis)分离核酸原理操作要点应用范围（一）分离核酸原理电荷效应分子筛效应分子构象1.电荷效应核酸是两性电解质pH=3.5,正电荷pH=8.0~8.3,负电荷，正极2.分子筛效应小分子移动快，大分子移动慢3.分子构象闭环超螺旋线状DNA开环DNA+-（二）操作要点支持物凝胶浓度的选择DNA分子量标准电泳缓冲液样品制备电泳条件DNA电泳染色DNA片段的回收1.支持物商品化的琼脂糖琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点80~90℃70℃80~90℃80~90℃机械强度中差高高分辨率中差中高2.凝胶浓度的选择凝胶的制备3.DNAmarkerDNAmarkerDNA长度标准曲线4.电泳缓冲液Tris-乙酸(TAE)pH8.0Tris-硼酸(TBE)pH8.0Tris-磷酸(TPE)pH8.05.样品制备上样缓冲液–50%甘油/蔗糖–0.5%溴酚蓝/二甲苯青点样6.电泳条件潜水电泳恒压电泳–低压:1~2V/cm–中压:8~10V/cm–高压电泳：几十V/cm温度：15~25℃潜水电泳7.电泳染色溴乙锭(ethidiumbromide,EB)结构及染色原理染色方法–加入凝胶液中–电泳结束后染色EB染色原理紫外灯下显色8.DNA片段的回收低熔点琼脂糖法透析袋电洗脱法(5kb)DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)（三）应用范围DNA的分离、纯化和鉴定–限制性酶切图谱分析–重组体的分离、鉴定–杂交分析–PCR产物的分离鉴定琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)分离原理操作要点优点应用范围（一）分离原理电荷效应分子筛效应PAGE支持物单体－丙烯酰胺(Acr)交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis)催化剂－过硫酸胺(AP)加速剂－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)聚丙烯酰胺凝胶（二）操作要点凝胶的分类凝胶浓度的选择凝胶液的配制凝胶中DNA的检测DNA片段的回收1.凝胶的分类非变性凝胶：dsDNA变性凝胶:ssDNA–尿素–甲酰胺–SDS2.凝胶浓度的选择3.凝胶液的配制试剂(ml)制备浓度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100mlPAGE装置电泳4.凝胶中DNA的检测溴乙锭染色法银盐染色法甲醛还原放射自显影法Ag+－DNAAg（黑褐色）5.DNA片段的回收压碎浸泡法–1kb–纯度高，回收率低（三）PAGE优点机械强度好、化学稳定性高分辨率高载样量大回收的DNA纯度高（四）PAGE应用范围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNADNA序列分析PCR产物鉴定蛋白质的检测和分析第二节分子杂交分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术一、分子杂交的基本原理核酸的变性和复性分子杂交DNA-DNADNA-RNA杂交条件靶分子探针杂交袋杂交炉杂交种类被检核酸种类和方法–原位杂交–斑点杂交–Southern杂交–Northern杂交–Western杂交反应介质–液相杂交–固相杂交()二、固相支持物固相支持物的特性–结合能力强–不影响杂交反应–结合牢固–非特异性吸附少–机械性能良好固相支持物的种类硝酸纤维素滤膜(nitrocellulosefiltermembrane)尼龙膜(nylonmembrane)1.硝酸纤维素滤膜特点–吸附ssDNA和RNA–杂交信号本底低不足–不适于重复杂交–滤膜较脆–不适于电转移印迹法–对DNA小片段(200bp)结合能力弱2.尼龙膜特点–结合能力强–可反复杂交–韧性强–适于电转移印迹法–对DNA小片段(10bp)结合能力强不足–杂交信号本底较高分子生物学考试时间：2005.1.11(晚7:00-9:00)地点–9教讲演厅(150人)–9-2-1(50人)–9-2-2(50人)–9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地点：逸夫楼3楼生化实验室三、探针(probe)探针的概念探针的类型标记物的种类标记方法1.探针的概念特异结合和检测靶分子的活性物质–抗原－抗体–配体－受体–同源DNA/RNA2.探针的类型基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针蛋白质或多肽探针3.标记物的种类放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)非放射性标记物–生物素–地高辛–荧光素–酶4.核酸探针的放射性标记方法DNA缺口平移标记法随机引物标记法DNA的5’末端标记缺口翻译特点均一标记制备dsDNA探针随机引物标记法(randompriming)随机引物–6nt–含有各种可能的排列顺序特点–放射比活性缺口翻译–操作简便–DNA/cDNA探针DNA的5’末端标记(5’endlabeling)碱性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶标记原理制备寡核苷酸探针制备短的DNA/RNA探针DNA的5’末端标记四、Southern杂交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印迹(blotting):转移–blot:aspotormark,esp.ofink–blotting1.印迹的方法毛细管转移法电转移法真空转移法毛细管转移法电转移法真空转移法2.Southern杂交的步骤3.Southern杂交的应用基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析RFLP五、Northern杂交RNAblotting步骤总RNA/mRNA→变性电泳分离→转移→杂交→放射自显影/化学显色应用–检测组织/细胞中mRNA的大小、量–比较不同组织/细胞中基因的表达情况Northern杂交六、Western杂交免疫印迹(immunoblotting)SDS-PAGE→转移→蛋白－第一抗体→标记的第二抗体(探针)→检测应用---蛋白质的定性定量分析免疫印迹Southern,Northern&Western待测物质支持物探针转移方式SouthernDNANC单链核酸毛细管/电/真空NorthernRNANC/尼龙单链核酸毛细管/电/真空Western蛋白质NC/PVDF抗体电转移七、原位杂交(insituhybridization)定义种类–细胞内原位杂交–组织切片原位杂交基本程序细胞/组织固定预杂交杂交冲洗杂交信号检测分析结果组织切片八、斑点杂交(dothybridization)第三节PCR技术聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)PCR的发展简史PCR的基本原理和步骤PCR的影响因素PCR的种类PCR的应用一、PCR的发展简史1971年,Korana提出核酸体外扩增的设想1985年,Mullis等发明了PCR技术1988年,PE-Cetus公司推出了第一台PCR仪二、PCR的基本原理和步骤基本原理－DNA复制三个步骤–变性(denaturation)–退火(annealing)–延伸(extension)PCR的原理PCR的扩增产物cycle12345n长片段246810短片段002822长＋短21222324252n标准的PCR反应体系10X扩增缓冲液：10ul模板DNA:0.1~2ug引物：各0.2~1umol/L4种dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U总体积：100ul三、PCR的影响因素模板引物TaqDNA聚合酶4种dNTPMg2+循环条件模板DNARNAcDNA对模板的纯度要求低引物长度：15～30ntG+C含量：40~60%碱基的随机分布避免引物自身和引物之间的互补引物的3’端引物的5’端引物浓度：0.2~1umol/LTaqDNA聚合酶2.5U/100ul－20℃保存最后加底物4种dNTP的浓度相等终浓度：200umol/LMg2+浓度:1.5～2.0mmol/L过高:非特异扩增过低:反应产物减少循环条件变性温度和时间:90~96℃,30~60s退火温度和时间:40~60℃,30~60s–Tm=4(G+C)+2(A+T)延伸温度和时间–70～75℃(72℃)–1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循环次数:25～35四、PCR的种类反转录PCR原位PCR(insituPCR)实时PCR(realtimePCR)重组PCR(recombinantPCR)锚定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)原位PCR原位杂交＋PCR程序固定细胞/组织样品→PCR前处理→PCR扩增→原位杂交及检测实时PCR的原理五、PCR的应用分子生物学研究临床医学分子生物学研究基因克隆DNA序列测定基因的体外定点突变突变分析(PCR-SSCP)基因定量临床医学病原体诊断遗传病的基因诊断肿瘤检测法医学第四节DNA序列测定Sanger双脱氧链终止法(1977)Maxam-Gilbert化学裂解法(1977)Sanger双脱氧链终止法原理－DNA复制反应条件–模板–引物–dNTP（其中一种带放射性标记）–ddNTP–DNA聚合酶DNA的复制2’,3’-双脱氧核苷酸(ddNTP)DNA测序操作DNA自动测序DNA自动测序仪第六节生物芯片(Biochip)20世纪90年代末生物分子之间相互作用的特异性种类细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、基因芯片、蛋白质芯片基因芯片概念种类应用领域表达谱基因芯片及其检测原理应用举例什么是基因芯片？基因芯片(Genechip,DNAchip),又称为DNA微阵列(DNAMicroarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将大量寡核苷酸或cDNA有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。基因芯片芯片的制备基因芯片的种类表达谱基因芯片诊断芯片检测芯片基因芯片的应用领域基因芯片基因表达谱疾病诊断药物筛选新基因寻找测序基因分型基因突变………………表达谱基因芯片及其检测原理研究在不同组织或细胞、不同发育阶段中基因的表达差异，进而阐明基因的功能检测原理表达谱基因芯片应用举例用基因表达谱芯片研究人正常和肝细胞癌中差异表达的基因肿瘤的分型及预测–1999年，Gulop等–急性白血病的分型•AML(13/10)•ALL(25/24)