分子荧光的机理和荧光探针原理

1.3荧光分子探针识别机理1.3.1光诱导电子转移[4,12](PhotoinducedElectronTransfer,PET)典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。图1-1PET荧光探针的一般原理图LUMO图1-2PET荧光探针的前线轨道原理图已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。deSilva研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被MolecularProbe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。deSilva研究小组利用类似于EDTA结构的氨羧酸基团设计的化合物3是螯合型PET荧光分子探针，识别基羧酸基团形成一个小的空穴，可以有效螯合碱土金属Ca2+和Mg2+。大多数PET荧光分子探针的设计是基于受体与客体结合，使光诱导电子转移作用受到抑制，荧光团发射出强烈荧光的原理，但是当与过渡金属作用时，结果有时会发生变化。由于过渡金属3d电子的氧化还原行为，可以发生从荧光团到键合过渡金属的电子转移，或者从过渡金属到荧光团的电子转移，因此可以通过无辐射能量转移导致荧光淬灭。化合物4受体冠醚为硫杂冠醚，众所周知，硫杂冠醚与Cu2+有强的亲和能力，该分子设计也是基于PET过程，但不同的是，与Cu2+键合后产生了从荧光团到金属离子的PET过程，导致荧光淬灭。1.3.2分子内电荷转移(IntramolecularChargeTransfer,ICT)典型的ICT荧光分子探针是荧光团上分别连接强推电子基和吸电子基，是一个强推-拉电子体系，推电子基和吸电子基、荧光团共轭相连，在光激发下会产生从电子给体向电子受体的电荷转移。ICT荧光探针的识别基团往往是推-拉电子体系整体中的一部分，当识别基团与客体结合时，会对荧光团的推-拉电子作用产生影响，减弱或是强化分子内电荷转移，从而导致荧光光谱的变化，如光谱发生蓝移，或是红移（图1-3）。化合物5为典型的ICT荧光探针，氮杂冠醚既是识别基团，同时也是推-拉电子体系的电子给体。当冠醚与碱土金属离子如Ca2+络合时，由于金属离子的拉电子效应，降低了冠醚氮原子的供电子能力，因此发生荧光蓝移，且荧光增强。识别基团6为电子受体的典型ICT荧光探针化合物6，二甲氨基为推电子基，当识别基团与碱土金属Ca2+结合后，拉电子能力增强，发生荧光红移。化合物7为螯合型的ICT荧光分子探针，可以选择性地与Mg2+络合。多数ICT荧光探针在结合客体后，光谱都有明显移动，但荧光强度变化不明显。然而化合物8是一个例外，与Li+络合后荧光增强90倍，与Mg2+络合增加2250倍。1.3.3激发单体-激基缔合物(Monomer-Excimer)当两个相同的荧光团，如多环芳烃萘、蒽和芘等连接到一个受体分子的合适位置时，其中一个被激发的荧光团（单体）会和另一个处于基态的荧光团形成分子内激基缔合物。它的发射光谱不同于单体的发射光谱，表现为一个新的、强而宽、长波、无精细结构的发射峰。由于形成这种激基缔合物需要激发态分子与基态分子达到“碰撞”距离（约35纳米），因此荧光团间的距离是激基缔合物形成和破坏的关键。所以用各种分子间作用力改变两个荧光团间的距离，用结合客体前后单体/激基缔合物的荧光光谱变化表达客体被识别的信息。萘、蒽、芘等荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基缔合物，常常被用于此类探针中。化合物9，通过乙二胺连结两个萘分子，Hg2+的加入导致激基缔合物荧光增强；化合物10具有双芘荧光发色团，能以不同的方式选择性响应Cu2+和Hg2+；化合物11是两个萘荧光团通过聚醚链连接的荧光化合物，碱土金属离子Ca2+、Ba2+可以与氧乙烯链上的多个氧原子以及酯键上的氧原子络合，造成链的收缩，使两个萘环得以靠近，促进激基缔合物的形成，使萘单体发射荧光强度减弱。1.3.4荧光共振能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)当能量给体荧光团（D）与能量受体荧光团（A）相隔的距离远大于D-A的碰撞直径时，只要D与A的基态和第一激发态两者的能级间能量差相当，或者说D的发射光谱与A的吸收光谱能有效重叠，就可能发生从D到A的非辐射能量转移。实际上D-A发生能量转移两者除了光谱重叠外，还必须以适当的排列方式，A可以是荧光团，也可以是荧光淬灭团。前一种情形，激发D时，由于能量转移，将观察到A的荧光发射；而后一种情形，则只能观察到D的荧光变化，多用于核酸的检测。化合物12中有两个不同的荧光团，分子中的脂肪叔胺能够通过PET淬灭蒽的荧光，在酸性条件下，该PET过程被禁阻，但蒽被激发后并不发射荧光，而是将能量转移给查耳酮使其发射荧光。1.3.5基于其他原理的荧光分子探针大多数阳离子荧光分子探针是基于上述原理设计的，还有少量探针是按照其它原理设计的，也许有些是意外所得，但常常有出奇制胜的效果。化合物13的乙腈溶液中加入汞离子后荧光显著增强（34倍）并红移，进一步用质谱检测发现生成了脱硫产物14。化合物13是对汞离子有选择性的化学反应荧光探针，这类不可逆的化学计量性识别分子也被称为化学计量剂。化合物15在pH=4.75的缓冲溶液中，加入Cu2+后荧光淬灭，溶液颜色从橙色变为黄色，该识别过程被称为光学双通道识别。化合物16在中性缓冲溶液中，加入Ag+后黄绿色荧光淬灭，溶液颜色从浅黄色变为红色。化合物17在水溶液中，加入Hg2+后荧光淬灭。这些双通道识别具有很好的选择性，另外，也为这些离子的检测提供了方便、直观的方法。