核酸(DNA-and-RNA)的细胞核定位观察

首都师范大学生物实验报告科目：细胞生物学班级：师范班姓名：王攀学号：1110800065实验名称：核酸(DNAandRNA)的细胞核定位观察日期：10.16一、实验目的：1、掌握细胞水平的核酸（DNA、RNA）固定、染色、分色的基本原理和方法；2、验证性实验是成熟实验，所以一定要快且有结果。二、实验原理：1、Unna染色法原理：核酸是酸性的，它们对于碱性染料具有亲和力，但是DNA和RNA对甲基绿-派洛宁混合染料的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。2、固定的目的和意义：为了使切取的标本最终能真实地反映其生活状态下正常的结构，必须用物理或者化学的手段迅速地杀死组织和细胞，使组织和细胞中的各种细胞器以及大分子保持生活状态的结构，并牢固地固定在其以原来的位置上。3、分色剂：根据染液浓淡及是否使用分色剂而分，显色法可以分为：渐进法（累积法）：染色液较淡，材料放入较长时间，使其慢慢染至合适为止。后退法（回复法）：将材料置浓染色液中使其过度染色，然后以分色剂使其退色至适度，这种退色称分色。4、设计对照实验：设计对照实验目的：证明和肯定实验结果的特异性和准确性。阳性对照：用确证含染色对象的标本作对照，实验结果应呈阳性结果；当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要，用以排除假阴性。阴性对照：用确证不含染色对象的标本作对照，实验结果应呈阴性结果；当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。5、核酸（DNA和RNA）的分子组成：一个核苷酸是由一分子含氮的碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。DNA是染色体的主要成分，主要在细胞核质内呈双螺旋结构。RNA是单链线形，主要有三种类型:（1）rRNA含量大，占细胞RNA总量的80％左右，是核糖体的重要组成部分，而rRNA的合成、加工和核糖体大、小亚单位的装配都是在核仁中进行的。（2）tRNA约占全部RNA的15％，它在蛋白质生物合成过程中具有转运氨基酸的作用。（3）mRNA的含量最少，只占5％左右，它是以DNA为模板合成的，它又是蛋白质合成的模板。三、实验药品：实验材料：洋葱鳞茎表皮细胞实验试剂：Carnoy固定液：无水乙醇：冰乙酸（3：1）：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。95%乙醇和70%乙醇和H2O：浓度由高到低，缓慢使细胞复水，防止一次复水效果不好。5%的三氯乙酸（TCA）：蛋白质沉淀剂和显微样品固定剂。Unna染液:DNA和RNA对甲基绿-派洛宁混合染料的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。丙酮：分色剂。能够使强染色褪色，达到分色的目的。四、实验步骤：五、实验结果及分析：实验结果：如图。实验分析：（1）经过后退法染色，将处理好的洋葱表皮置浓unna染液中使其过度染色，将然后用丙酮使其退色至适度。结果如图一、图二。DNA和RNA对甲基绿-派洛宁混合染料的亲和力不同，使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，使细胞中两种核酸分布显示出来。所以图一中每个细胞核都有蓝色和红色之分。又因为rRNA是核糖体的重要组成部分,而rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的装配都是在核仁中进行的。所以呈红色的为细胞核的核仁。蓝色的为富含丰富DNA的细胞核。（2）图三为此实验阴性对照。因为经过处理，对照组的洋葱表皮已经不含有细胞核等细胞结果，所以无色，呈阴性结果，来排除假阳性。123140倍镜下染色呈阳性的洋葱表皮细胞210倍镜下染色呈阳性的洋葱表皮细胞340倍镜下染色呈阴性的洋葱表皮细胞细胞核（DNA）核仁（RNA）洋葱细胞无核洋葱细胞六、反思与改进1、我们组实验的核仁较小。可能是因为所取洋葱表皮的地方较靠内，细胞发育的不太完全，所以核仁较小。建议以后可以选取发育较完全的洋葱内皮细胞作为研究对象。2、因为在做实验的过程中，一直在努力使洋葱表皮展平，所以染色结果较好，以后可以借鉴。3、在染色过程中应将表皮全部浸入染色液中，这样可以使染色更均匀。4、在用丙酮的时候，应注意控制时间，这是染色成功的关键。建议控制在6~10s内。5、因为对照组需要水浴加热，所以容易把洋葱内皮煮烂，所以建议可否缩短水浴时间，或者降低温度，这样可以使其对照组不容易被破坏。七、思考题1.甲基绿-派洛宁（mehtyl-green-pyronim）染色法的基本原理？比较中学用吡罗红甲基绿的结果。答：核酸是酸性的，它们对于碱性染料具有亲和力，但是DNA和RNA对甲基绿-派洛宁混合染料的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。中学染色因没有分色，所以细胞质也被染色，结果不够清晰。2.DNA和RNA的亚细胞定位在哪里?为什么？答：DNA定位在细胞核中，RNA定位在细胞核的核仁中。因为rRNA是核糖体的重要组成部分,而rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的装配都是在核仁中进行的。所以呈红色的为细胞核的核仁。又因为DNA主要存在于细胞核中，所以细胞核为蓝色。3.本实验为什么要设立对照组？答：此实验阴性对照。因为经过处理，对照组的洋葱表皮已经不含有细胞核等细胞结果，所以无色，呈阴性结果，来排除假阳性。4.本实验中丙酮起什么作用？答：分色剂。能够使强染色褪色至适度，达到分色的目的。