农用微生物菌剂(GB 20287-2006)

农用微生物菌剂（GB20287-2006）前言本标准的5.1、5.3和第8章条文为强制性条款，其余为推荐性条款。本标准的附录A、附录C和附录D为规范性附录，附录B为资料性附录。农用微生物菌剂1范围本标准规定了农用微生物菌剂（即微生物接种剂）的术语和定义、产品分类、要求、试验方法、检验规则、包装、标识、运输和贮存。本标准适用于农用微生物菌剂类产品。2规范性引用文件（略）3术语和定义（略）4产品分类产品按剂型可分为液体、粉剂、颗粒型；按内含的微生物种类或功能特性可分为根瘤菌菌剂、固氮菌菌剂、解磷类微生物菌剂、硅酸盐微生物菌剂、光合细菌菌剂、有机物料腐熟剂、促生菌剂、菌根菌剂、生物修复菌剂等。5要求5.1菌种生产用的微生物菌种应安全、有效。生产者应提供菌种的分类鉴定报告，包括属及种的学名、形态、生理生化特性及鉴定依据等完整资料。生产者应提供菌种安全性评价资料。采用生物工程菌，应具有允许大面积释放的生物安全性有关批文。5.2产品外观（略）5.3产品技术指标5.3.1农用微生物菌剂产品的技术指标见表1，其中有机物料腐熟剂产品的技术指标按表2执行。表1农用微生物菌剂产品的技术指标项目剂型液体粉剂颗粒有效活菌数(cfu)a，亿/g(mL)≥2.02.01.0霉菌杂菌数，个/g(mL)≤3.0×1063.0×1063.0×106杂菌率，%≤10.020.030.0水分，%≤-35.020.0细度，%≥-8080pH值5.0~8.05.5~8.55.5~8.5保质期b，月≥36a复合菌剂，每一种有效菌的数量不得少于0.01亿/g(mL)；以单一的胶质芽胞杆菌（Bacillusmucilaginosus）制成的粉剂产品中有效活菌数不少于1.2亿/g。b此项仅在监督部门或仲裁双方认为有必要时检测。表2有机物料腐熟剂产品的技术指标项目剂型液体粉剂颗粒有效活菌数(cfu)，亿/g(mL)≥1.00.500.50纤维素酶活a，U/g（mL）≥30.030.030.0蛋白酶活b，U/g(mL)≥15.015.015.0水分，%≤-35.020.0细度，%≥-7070pH值5.0～8.55.5～8.55.5～8.5保质期c，月≥36a以农作物秸秆类为腐熟对象测定纤维素酶活。b以畜禽粪便类为腐熟对象测定蛋白酶活。c此项仅在监督部门或仲裁双方认为有必要时检测。5.3.2农用微生物菌剂产品中无害化指标见表3。表3农用微生物菌剂产品的无害化技术指标参数标准极限粪大肠菌群数，个/g(mL)≤100蛔虫卵死亡率，%≥95砷及其化合物（以As计），mg/kg≤75镉及其化合物（以Cd计），mg/kg≤10铅及其化合物（以Pb计），mg/kg≤100铬及其化合物（以Cr计），mg/kg≤150汞及其化合物（以Hg计），mg/kg≤56试验方法6.1仪器设备（略）6.2试剂（略）6.3产品参数的检测6.3.1外观(感官)的测定取少量样品放到白色搪瓷盘(或白色塑料调色板)中，仔细观察样品的颜色、形状、质地。6.3.2有效活菌数的测定采用平板计数法，根据所测微生物的种类选用适宜的培养基。若采用最大可能数（MostProbableNumber，MPN）5管法，遵照附录C的规定。6.3.2.1系列稀释称取样品10g（精确到0.01g），加入带玻璃珠的100mL的无菌水中(液体菌剂取l0.0mL加入90mL的无菌水中)，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成母液菌悬液（基础液）。用无菌移液管分别吸取5.0mL上述母液菌悬液加入45mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。6.3.2.2加样及培养每个样品取3个连续适宜的稀释度，用无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀地涂于琼脂表面。每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，于适宜的条件下培养。6.3.2.3菌落识别根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。6.3.2.4菌落计数以出现20~300个菌落数的稀释度的平板为计数标准（丝状真菌为10~150个菌落数），分别统计有效活菌数目和杂菌数目。当只有一个稀释度，其平均菌落数在20～300个之间时，则以该平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数均在20～300个之间时，应按两者菌落总数之比值决定。若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以稀释度小的菌落平均数计算。有效活菌数按式（1）或式（2）计算：nm=xkv1/(m0v2)×10-8…………………（1）nv=xkv1/(v0v2)×10-8…………………（2）式中：nm—质量有效活菌数，亿/gnv—体积有效活菌数，亿/mLx—菌落平均数，个k—稀释倍数v1—基础液体积，mLv2—菌悬液加入量，mLv0—样品量，mLm0—样品量，g6.3.3霉菌杂菌数的测定采用马丁培养基，测定方法同6.3.2。6.3.4杂菌率的测定除样品有效菌外其它的菌均为杂菌。样品中杂菌率按式（3）计算：m=n1/(n1+n)×100…………………（3）式中：m—样品杂菌率，%n1—杂菌数，亿/g(mL)n—有效活菌数，亿/g(mL)6.3.5水分的测定将空铝盒置于干燥箱中105℃±2℃烘干0.5h，冷却后称量记录空铝盒的质量。然后称取2份平行样品（颗粒型样品，应先粉碎过1.0mm试验筛），每份20g（精确到0.01g），分别加入铝盒中并记录质量。将装好样品的铝盒置于干燥箱中105℃±2℃下烘干4h~6h。取出置于干燥器中冷却20min后进行称量。水分含量按式（4）计算（结果为两次测定的平均值）：w=(m1-m2)/(m1-m0)×100…………………（4）式中：w—样品水分含量，%m0—空铝盒的质量，gm1—样品和铝盒的质量，gm2—烘干后样品和铝盒的质量，g6.3.6细度的测定6.3.6.1粉剂样品称取样品50g（精确到0.1g），放入300mL烧杯中，加200mL水浸泡10min~30min后倒入孔径0.18mm的试验筛中，然后用水冲洗，并用刷子轻轻地刷筛面上的样品，直至筛下流出清水为止。将试验筛连同筛上样品放入干燥箱中，在105℃±2℃烘干4h~6h。冷却后称量筛上样品质量。样品细度按式（5）计算：s={1-m1/[m0（1-w）]}×100…………………（5）式中：s—筛下样品质量分数，%m0—样品质量，gw—样品含水量，%m1—筛上干样品质量，g6.3.6.2颗粒样品称取样品50g（精确到0.1g），将两个不同孔径的试验筛（1.0mm和4.75mm）摞在一起放在底盘上(大孔径试验筛放在上面)。样品倒入大孔径试验筛内筛样品，然后称小孔径试验筛上的样品质量。颗粒细度按式（6）计算：g=m1/m0×100…………………（6）式中：g—样品质量分数，%m1—小孔径试验筛上样品质量，gm0—样品质量，g6.3.7pH值的测定打开酸度计电源预热30min，用标准溶液校准。pH值的测定，每个样品重复三次，计算三次的平均值。6.3.7.1液体样品用量筒取40mL样品放入50mL的烧杯中，直接用酸度计测定，仪器读数稳定后记录。6.3.7.2粉剂样品称取样品15g，放入50mL的烧杯中，按1:2(样品:无离子水)的比例将无离子水加到烧杯中(如果样品含水量低，可根据基质类型按1:3~1:5的比例加无离子水)，搅拌均匀。然后静置30min，测样品悬液的pH值，仪器读数稳定后记录。6.3.7.3颗粒样品样品先研碎过1.0mm试验筛，按照6.3.7.2的方法测定。6.3.8粪大肠菌群数的测定应符合GB/T19524.1《肥料中粪大肠菌群的测定》的规定。6.3.9蛔虫卵死亡率的测定应符合GB/T19524.2《肥料中蛔虫卵死亡率的测定》的规定。6.3.10纤维素酶活、蛋白酶活的测定应符合附录D的规定。6.3.11砷、镉、铅、铬、汞的测定应符合GB18877—2002中的5.12~5.17的规定。6.3.12保质期的检验在产品说明书标明的保质期前，按6.3.1~6.3.11方法测定产品相应指标。7检验规则本标准中产品技术指标的数字修约应符合GB8170的规定；产品质量合格判定应符合GB1250中修约值比较法的规定。7.1抽样按每一发酵罐菌液（或每批固体发酵）加工成的产品为一批，进行抽样检验，抽样过程严格避免杂菌污染。7.1.1抽样工具无菌塑料袋(瓶)，金属勺、抽样器、量筒、牛皮纸袋、胶水、抽样封条及抽样单等。7.1.2抽样方法和数量一般在成品库中抽样，采用随机法抽取。抽样以件为单位，小包装以每一包装箱为一件。随机抽取3~5件，每件中随机抽取一袋(瓶)；若每袋(瓶)包装小于500g（mL）的产品，应多抽几件。大包装产品以一袋(桶)为一件，随机抽取5~10件，在无菌条件下，每件取样500g(mL)，然后将抽取样品混匀，按四分法分装3袋(瓶)，每袋（瓶）不少于500g(mL)。7.2检验分类（略）7.3判定规则7.3.1具下列任何一条款者，均为合格产品a.检验结果各项技术指标均符合标准要求的产品；b.在产品的外观、水分、细度、pH值等检测项目中，有1项不符合要求，而其它各项技术指标符合要求的产品。7.3.2具下列任何一条款者，均为不合格产品a.有效活菌数不符合技术指标；b.霉菌杂菌数不符合技术指标；c.杂菌率不符合技术指标；d.粪大肠菌群不符合技术指标；e.蛔虫卵死亡率不符合技术指标；f.砷、镉、铅、铬、汞中任一含量不符合技术指标；g.有机物料腐熟剂产品中所测酶活不符合技术指标；h.在外观、水分、细度、pH值等检测项目中，有2项（含）以上不符合要求。8包装、标识、运输和贮存参见NY885-2004《农用微生物产品标识要求》附录A常用检测培养基参见NY/T1114-2004《微生物肥料实验用培养基技术条件》附录B（资料性附录）常用染色剂B.1革兰氏染色剂B.1.1结晶紫染色液（Hucker氏配方）甲液：结晶紫（Crystalviolet）2.0g乙醇(95%)20.0mL乙液：草酸铵[(NH4)2C2O4•H2O]0.8g蒸馏水80.0mL甲、乙两液相混，过滤，棕色瓶保存。B.1.2卢哥(Lugol)氏碘液碘(I2)片1.0g碘化钾(KI)2.0g蒸馏水300mL先溶碘化钾于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，可稍加热，最后加足蒸馏水，棕色瓶保存。B.1.3脱色液95%的乙醇液。B.1.4复染液0.5%的番红水溶液（SafraninO)2.5%的番红酒精溶液20mL蒸馏水80mLB.2芽胞染色液B.2.1孔雀绿染色液（Malachitegreen）孔雀绿5.0g蒸馏水100mLB.2.20.5%番红染色液B.3石碳酸复红染色液甲液：碱性复红(Basicfuchsin)0.3g95%酒精10.0mL乙液：石碳酸(PhenoecrystalsC.P)5.0g蒸馏水95mL将甲、乙两液混合后即得石碳酸复红染色液原液。染色时，将原液稀释5~10倍使用。附录C（规范性附录）稀释法（MPN5管法）C.1稀释称取样品10.0g，加入带玻璃珠的100mL的无菌水中(液体菌剂取l0.0mL加入90mL的无菌水中)，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即得到1×101稀释度的菌悬液。用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1×102稀释度的菌悬液，依此方法制成1×103、1×104、1×105……稀释度的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。C.2加样选择适宜的5个连续稀释度，用无菌移液管分别吸取不同稀释度的菌悬液1.0mL，加到已准备好的盛有9.0mL无菌培养基的螺口试管中，每一稀释度重复接5支试管（不同稀释度间更换无菌移液管），同时用无菌培养液作对照。C.3培养接种后