柠檬酸生产工艺简介

柠檬酸生产工艺简介第一节概述一、柠檬酸的用途（一）在食品工业的应用1、饮料据统计75%～80%的柠檬酸用于饮料工业。2、果酱与果冻3、糖果4、冷冻食品5、酿造酒6、冰淇淋和酸奶7、脂肪与油8、腌制品9、罐头食品和水果加工10、豆制品和调味品（二）柠檬酸在药物、美容品、化妆品上应用1、药物“999胃泰”2、发蜡与化妆品（三）柠檬酸在工业上应用1、金属净化2、去垢剂3、无土栽培农艺4、矿物5、……二、乳酸的用途L-乳酸聚合成聚乳酸（PLA）三、L-苹果酸的用途三、葡萄糖酸的用途四、琥珀酸的用途我国柠檬酸发展简史1968年我国第一家以淀粉为原料深层发酵柠檬酸成功投产的厂是上海酵母厂。同期，天津工微所开展了以适合我国国情的薯干原料深层发酵柠檬酸的研究工作。之后，上海工微所用该所的“东酒2号”黑曲霉为出发菌株，用薯干粉做培养基，很快选出了我国第一代深层发酵柠檬酸生产菌种AL558，由原轻工业部立项，组织上海、天津两个工微所、上海复旦大学生物系、上海新型发酵厂(筹)、上海酵母厂、天津柠檬酸厂(筹)、南通油洒厂(南通发酵厂前身)等单位，在南通油酒厂展开了善于深层发酵、全离交提取工艺的中、大型试验工作，并取得了成功，因而推动了我国柠檬酸工业于20世纪70年代初形成了工业体系。70年代中期到80年代是我国柠檬酸菌种选育的高峰期，先后选育出5代薯干原料高产菌株和适应淀粉、木薯、葡萄糖母液、糖蜜等原料的优良菌株。上海、天津两工微所和上海复旦大学生物系为此做出了很大贡献。各生产厂的广大科技人员和生产工人通过不懈地努力，提高了柠檬酸行业的整体水平，特别在缩短发酵周期、提高单产方面成绩突出，使我国柠檬酸发酵技术处于世界领先地位。无锡轻工业学院和天津轻工业学院为柠檬酸行业培养了一大批科技力量，已成为行业发展的骨干。1995年金其荣与蚌埠柠檬酸厂共同开发了玉米去渣发酵新工艺。同年黑龙江甘南柠檬酸厂于脱胚玉米去渣发酵工艺也成功投产。玉米新工艺的成功，使我国的柠檬酸工业进入一个新时期。柠檬酸的命名第二节柠檬酸发酵机制与代谢调控黑曲霉柠檬酸生物合成途径黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。（1）生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP：HMP=2：1，后者EMP：HMP=4（2）黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。（3）由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。柠檬酸生物合成的理想途径黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控（一）柠檬酸积累的调节1、糖酵解及丙酮酸代谢的调节已清楚，其活性不受代谢产物的调节。2、三羧酸循环的调节（1）柠檬酸合成酶的调节柠檬酸合成酶是TCA环中的第一个酶，但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。（2）顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节顺乌头酸水合酶、NAD、NAD-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：7。并发现在柠檬酸发酵中，无论培养基中是否存在铁离子，顺乌头酸水合酶催化的反应总是趋向柠檬酸一侧，保证柠檬酸得到充分积累。一旦柠檬酸积累到一定水平．细胞内的PH下降，就能抑制顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，就抑制了柠檬酸自身的进一步分解。黑曲霉中的异柠檬酸脱氢酶有三种：一种NAD异柠檬酸脱氢酶．活力很低。两种NAD异柠檬酸脱氢酶，其一在细胞质中，不受柠檬酸抑制，其二在线粒体中．与TCA循环有关，它受生理浓度的柠檬酸抑制，所以当柠檬酸积累到一定水平时，就抑制此酶的活力，从而更加促进柠檬酸的积累。NAD异柠檬酸脱氢酶的抑制作用在碱性pH和30mmol／L锰离子时被解除，这就是国外菌种柠檬酸积累受锰离子毒害的缘故之一。(3)α-酮戊二酸脱氢酶酌调节在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是。α-酮戊二酸脱氢酶的合成受高葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生长期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是了TCA循环中唯一不可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：⑦TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制NM—异柠檬酸脱氢酶的活性。（二）Mn2+调节比较Mn2+丰富和Mn2+缺乏的分批培养时发现，当黑曲霉在缺Mn2+的产柠橡酸培养基中，菌体的组成代谢(戊糖磷酸途径，生糖途径)的酶和三羧酸循环的脱氢酶活力显著降低。不论锰丰富或缺乏，都未检出α-酮戊二酸脱氢酶。乙醛酸循环的脱氢酶也几乎无活力。当缺锰时，HMP和TCA循环水平低，生长期菌丝的蛋白质、核酸和脂肪含量明显减少，而氨基酸和铵离子水平升高，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，柠檬酸大量积累。当黑曲霉生长在缺锰的高浓度糖培养基中，细胞内铵离子异常高，达25mmol／L，随之出现谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨政和γ—氨基丁酸的积累和分泌，使铵离子对细胞毒性被解除。这些氨基酸的积累是由于测报蛋白质合成受到干扰，导致蛋白质分解增加，细胞内蛋白质和核酸的减少所致。当锰离子充足时，添加环己酰亚胺，可促进铵离子和氨基酸积累，由此可知，铵离子积累是由于蛋白质和RNA转换过程中细胞蛋白质的再合成受损伤引起的。锰离子是催化核糖核酸形成聚合阶段第一步反应酶所需的，若猛离于缺乏，核酸、蛋白质合成受阻，而使细胞内的铵离子水平升高。铵离子水平升高解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的抑制．从而增加EMP代谢流量，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，而使柠檬酸大量积累，这就是锰离子的调节效应。（三）氧对柠檬酸积累的调节乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：(1)从图2—3—7可知氧是发酵过程(EMP途径和丙酮酸脱氢)生成的NADH2重新氧化的氢受体。〔2〕近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链，如图2—3—7所示。此侧系呼吸链对水杨酸酰异肟酸(SHAM)敏感，在黑曲霉生长期，此侧链不受水杨酸酰异肟酸的抑制。在柠檬酸发酵产酸期受SHAM的强烈抑制。通过标准呼吸链氧化时产生ATP，会反馈抑制PFK酶，而通过侧系呼吸链不产生ATP，而当缺氧时．只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，从而导致柠檬酸产酸急剧下降。一旦恢复供氧，标准呼吸链复活，而不影响菌的生长；但侧系呼吸链却不能恢复，故对产酸速率有很大影响。所以柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定要充足氧的供给，以保证更多的NHDH2通过侧系呼吸链将H2交给O2生成CO2和H20，使呼吸产生的ATP减少，解除ATP对PFK酶的反馈抑制。使EMP代谢流增大，丙酮酸和草配乙酸生成水平提高，柠檬酸产率提高。三、黑曲霉柠檬酸发酵机制(1)由于严格限制供给话离子等金属离子，或筛选耐高浓度锰离于、锌离子、铁离子等金属离子的菌株，降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力，使细胞中形成高水平的铵离子，从而解除柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增大；(2)存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链，对氧敏感，但不产生ATP，这样使细胞内的ATP浓度下降。因而减轻了ATP对PFK酶、CS酶的反馈抑制，促进了EMP途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成；(3)丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定反应取平衡，保证前体物乙酰CoA和草酰乙酸的提供，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能力；(4)α-酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏．使黑曲霉中的TcA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TcA循环，降低细跑内ATP浓度，另外使，α-酮戊二酸浓度升高。反过来．又反馈抑制异柠檬政脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解；(5)顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，即柠檬政分解活力低。一旦柠檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进柠檬酸自身积累，pH降至2．o以下。顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸积累并排出体外。第三节柠檬酸发酵生产菌种黑曲霉（Asp.niger）一、黑曲霉柠檬酸的形态特征(1)在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色，不是绒球状，凸起．边缘整齐，菌落较小，带皱折。在麦芽汁培养基上生长4d成熟的孢子呈黑褐色。(2)在察氏培养基上生长较慢，菌落边缘整齐，分生孢子梗短，分生孢子着生较密。(3)菌丝顶端着生稀疏的大型的黑褐色孢子德，成熟后呈开花状而崩裂。(4)孢子柄(14—15)μ(1．5—2)μ。(5)顶囊球形d直径为50一72μm。(6)小梗分二层，初生小梗和次生小梗区别明显，初生小梗(30～31)×7μm，次生小便大多是3根，也有2根的，大小为(9～13)µm×3．8µm。(7)分生孢子串珠状着生，黑褐色，表面组糙且有明显的刺状突起，4．7—5．2µm，成熟后遇振动易散落。二、生活周期黑曲霉属半知菌纲，一般只进行无性繁殖，由孢子发芽开始到新孢子形成、成熟，为一个生活周期。图2—3-1所示是黑曲霉发芽和抱子形成过程。孢子在液体培养基中培养6—8h开始萌发出芽，长出多根芽，逐渐形成菌丝，菌丝不久即出现分枝。黑曲霉菌丝是多细胞结构，有横隔，其中可育细胞称为足细胞。由足细胞长出分生孢子梗，分生孢子梗顶端泡囊的聚集并与原生质膜的融合，使顶端膨大形成顶囊，上面退生二层小梗，小梗上长出成链的孢子。这样一个生活周期约50h，但黑曲霉菌丝是不断地生长延长的，孢子也逐渐不断地产生，直至营养枯竭为止。三、培养基四、黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征(1)能耐高浓度的柠檬酸(15％以上)，而不利用和分解柠檬酸。(2)耐高浓度葡萄糖，能产生和分泌大量的酸性α-淀粉酶和酸性糖化酶。其α淀粉酶在pH2.0仍能保持原活力的80％以上。在PH2.5，40℃下作用30min尚不失活。其糖化酶最适作用PH在4．O一4．6，最适温度为60一65℃。在柠檬酸发酵条件下，当培养pH下降至2．o以下时，仍能保持大部分活力。(3)能抗微量金属离子，尤其能抗较高浓度的Mn2+、Zn2+、Cu2+。(4)在深层液体发酵培养时，能形成大量的细小菌球体，菌球体直径为o．1mm，菌球量达104个／mL以上。(5)在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上，生长不好，生成小菌落，孢子形成能力弱。(6)在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的氨基酸、NH4+，即NH4+库水平高。(7)菌丝体中含有低水平的甘油三酯和磷酸酯。(8)细胞壁几丁质含量高，但β葡聚糖和聚半乳糖含量低。(9)在生长和产酸期，细胞内蛋白质、核酸水平低。(10)具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产生ATP。五、黑曲霉柠檬酸生产菌的分离选育柠檬酸生产菌的分离筛选与其他微生物相同，一是收集相当数量的现有菌种，经分离纯化，从中挑选出合适的菌株；二是采集大量的含菌样品，分离筛选出优良菌种。若收集现有菌种则可直接活化、分离、纯化，并测定每个菌株的性能，从中选出最优良的菌株；若是通过采集含菌样品来分离选育，可根据糖质发酵柠檬酸高产菌主要是黑曲霉，它们具有强大的分解淀粉、蛋白质、果胶、脂肪等物质的酶系特征，可从腐烂植物、水果表皮，也可从含有腐烂未热水果