天然产物的生物转化

天然产物的生物转化天然药物的生物转化一.生物转化的概念、意义与研究进展二.利用植物组织细胞培养系统进行的生物转化三.利用微生物细胞培养系统进行的生物转化四.利用生物酶制剂进行的生物转化五.展望一.生物转化的概念、意义与研究进展生物转化是指利用生物体系（包括微生物、植物和动力物）以及生物体系的酶制剂作为催化剂，对外源性底物进行结构修饰时所发生的化学反应。生物转化的本质是生物体系的酶对外源性底物的催化反应。生物催化体系是高效和具有选择性一个的温和催化体系。生物体系中的酶具有高度的化学选择性、区域选择性和立体专一性。生物转化反应可以完成许多化学方法不能或不易完成的反应，能够制备许多包括光学纯的医药、农业及中间体在内的复杂化合物，因此越来越受到生药学和天然药物化学工作者的重视。近年来，我国的生物转化研究取得了一定的进展，但与国际上相比，差距很大，集中体现在研究的生物转化反应类型和原始创新项目少，研究的酶类型单一。二.利用植物组织细胞培养系统进行的生物转化植物组织细胞培养液是一类新的生物转化系统，能对映选择地转化外来底物特点：1、植物酶与动物酶相比，具有原料易得，易繁殖且不需将酶从细胞中分离的特点。2、植物细胞转化法与微生物细胞转化法相比，植物细胞培养液得到的光学活性产物的光学产率高于微生物法3、与化学合成法相比，所需反应条件温和，易于操作，且不需要使用手性诱导物1.用植物悬浮细胞作为催化系统进行的生物转化反应2.用固定化植物细胞作为催化系统进行的生物转化反应3.用毛状根培养物作为催化系统进行的生物转化反应利用植物组织细胞培养系统进行的生物转化主要包括以下三个方面：1.用植物悬浮细胞作为催化剂进行的生物转化反应由游离植物悬浮细胞组成的生物转化系统具有直接使用前体，细胞转移限制少和不存在影响细胞活力和生理状态的介质等优点，因此，它是目前使用最多，也是取得结果最为满意的一个转化系统。由悬浮细胞所进行的生物转化反应多为一步反应，即加入前体后经悬浮细胞培养进行单一的化学反应而形成某一产物。方法与举例桔梗悬浮培养细胞对天麻素的生物转化1、桔梗无菌苗的获得剪取桔梗嫩茎洗净后用70%酒精浸泡30秒后放入0.1%HgCl2中灭菌15min，用无菌水冲洗3-5次，取出，剪成约1cm带节小段，接种于MS+2.0mg/L6-BA培养基中进行无菌苗诱导，约1周后，腋芽开始启动，3-4周后长成约5cm小苗。2、桔梗愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养体系的建立切取桔梗无菌苗的叶片和茎段,于MS+5.0mg/LNAA培养基中诱导愈伤组织的形成。将继代3次以上、生长较好的愈伤组织转入液体培养基中培养，开始3代每10天转接一次，第4-5代后细胞便能在液体培养基中稳定生长。培养温度均为25℃，黑暗培养，细胞悬浮培养时摇床转速为120转/分钟。3、桔梗悬浮细胞对天麻素的生物转化与产物检测底物天麻素用无水乙醇溶解。待桔梗细胞生长到15天时，用微量移液器吸取一定量的底物加入培养基中，使底物的加入浓度为60mg/L。8天后抽滤回收培养液，并用蒸馏水将培养物清洗3次，合并滤液，用等量乙酸乙脂萃取5次，减压浓缩溶剂，丙酮-石油醚中结晶后，进行波谱分析。桔梗悬浮培养细胞对天麻素的生物转化长春花悬浮细胞对天麻素的生物转化2.用固定化植物细胞作为催化剂进行的生物转化反应固定化培养就是把植物细胞用琼脂、聚丙烯酰胺、硅藻、有机橡胶等包埋后，再用交联剂进行渗透交联处理提高细胞的通透性的一种培养技术。采用离子交换，聚合，微囊化作用等措施，使细胞内的酶通过氢键、疏水作用力、偶极作用力等吸附在固体支持物上，可以有效地防止胞内酶的渗漏。由于包埋剂多为非极性物质，所以固定化培养更有利于非极性前体向细胞周围积聚和吸收，相对提高了底物的浓度，提高了底物转化的效率另外，细胞固定后生长和分化表达受到连续的抑制，在这种刺激下，次生代谢和生物转化的能力都会有所增加方法与举例固定的满天星细胞对苯乙酮的生物转化1、无菌满天星单细胞的获得与前面桔梗愈伤组织的培养方法相同，获得疏松的愈伤组织后，在500转/分钟的离心机离心30分钟，通过400目的细胞筛后，得到单细胞溶液。2、固定细胞的制备称取5克二甲基硅橡胶，0.5克甲基羟基硅油，0.25克正硅酸乙酯和0.07克辛酸亚锡混合均匀。加入悬浮于0.6ml0.8%NaCl溶液的0.2克满天星的单细胞，搅拌均匀。然后缓慢倒入100ml万分之一浓度的鼠李糖脂溶液中。室温下反应2小时后即可得到颗粒状的固定化细胞3、固定的满天星细胞对苯乙酮的生物转化和转化后产物的鉴定取0.2克包的固定化细胞，加入到40ml0.05ml/LpH7.0的磷酸缓冲液中，然后加入0.5ml溶有10mg苯乙酮的乙醇溶液，于25℃振荡反应。反应一定时间后取出5ml反应液，用乙醚提取3次，合并乙醚提取液，旋转蒸发干乙醚。蒸干物可通过薄层层析定性分析和高压液相定量分析还原情况。固定的满天星细胞对苯乙酮的生物转化固定的满天星细胞对苯乙酮的生物转化3.用毛状根培养物作为催化剂进行的生物转化反应毛状根就是指利用发根农杆菌侵染离体植物伤口以后，诱导植物形成快速的非向地性的高度分支的无规则根团。同植物细胞一样，毛状根培养物也可用于生物转化。与未分化的细胞培养物相比，毛状根的应用优势是很明显的，它具有增殖速度快（有些植物的毛状根在一个周期内可增殖1000倍以上），合成和转化能力强，遗传稳定性好等优点方法与举例人参毛状根生物转化氢醌合成熊果苷反应1、人参毛状根的获得取无菌试管苗的叶片，在诱导培养基中产生愈伤组织，然后用发根农杆菌与之共培养，一个月左右会有发状根出现。2、人参毛状根的培养取人参毛状根尖（20－30mm)于MS0液体培养基进行继代培养，继代时间30d，筛选生长旺盛，分支多且细长的毛状根培养物，转入B5培养基中进行液体振荡培养，暗培养（25士1）℃，110－120r/min。每瓶75mlB5培养基，pH调至5.8，每瓶接种150mg湿重的根。3、人参毛状根生物转化合成熊果苷的方法与产物鉴定待毛状根培养至一定阶段，将其生长培养基更换为75ml含一定浓度氢醌的B5培养基，以上述转速、温度培养一定时间。取熊果苷标准品，用流动相定容，制成标准品溶液；同时将培养到22天的毛状根转移到新的未加前体B5培养基中，培养24小时后，取出并用少量蒸馏水洗涤，-50℃冻干，研磨，过60目筛。精密称取粉末10mg置于10ml容量瓶中，加蒸馏水10ml,冷浸24h，超声10min后定容，0.2µm微孔滤膜过滤，得供试样品溶液。通过标准品溶液、未加前体样品溶液、样品溶液的谱图对比，确定人参毛状根是否能将氢醌合成为熊果苷人参毛状根生物转化氢醌合成熊果苷的反应三.用微生物细胞作为催化剂进行的生物转化反应微生物转化就利用微生物代谢过程中产生的酶催化底物发生的反应。微生物细胞的增殖比植物细胞更快，基因转化表达，基因重组，原生质体融合比动植物细胞更容易成功，所以整个过程可以实现自动化，连续化，转化效率更高根据细胞培养的方式，将微生物转化反应分为以下几类：1、分批培养转化法（不能连续使用）2、静止细胞转化法（连续使用，不完成培养基）3、应用孢子进行转化（杂质少，不完成培养基）4、应用渗透细胞进行的生物转化（表面活性剂）方法与举例微生物转化青蒿素为9α-羟基青蒿素的反应1、菌种的活化将保存于斜面固体培养上的微生物Streptomycesgriseus(ATCC-13273)从冰箱中取出，接种于液体培养基，28℃200r/min旋转培养培养48小时后，转接于另一液体培养基，同条件培养24小时。（二步法）2、转化方法与检测将活化的菌液加入100µl青蒿素溶液中，同条件培养84小时后，将发酵液取出，加等量乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，残渣加甲醇溶解定容为10ml，用孔径为0.45µm的微孔滤膜滤过，取续虑液用高效液相测定是否含有青蒿素。四、利用生物体系中的酶制剂进行的生物转化生物转化的催化剂主要有两种，全细胞和游离酶。两者的实质都是酶，但前者的酶保留在细胞中，后者则已从细胞中分离纯化。对于需要利用一种以上的酶和辅酶的复杂反应或不能游离使用的，通常采用全细胞的生物转化，但如果有某一种关键酶就能达到反应目的，则游离的酶更为简便。1、游离酶催化的转化反应在手性化合物上的研究合成手性药物的生物转化可分为两类：一类是外消旋体拆分为两个光活性的对映体，另一类是从外消旋体或前体出发，通过催化反应得到不对称的光活性产物。蛋白质酶是由L-氨基酸组成，其活性中心构成了一个不对称环境，酶只对外消旋体的单一对映体起作用，实现选择。生物法生产利用了酶的对映体催化专一性，只用两步就可以替代传统的化学法生产，从而减少了工艺流程，提高了产量和纯度。2、极端酶催化的转化反应在手性化合物上的研究极端酶是指在极端条件下稳定生存，并且具有独特的新成代谢途径的菌种中所含的酶。酶作为生物催化剂，已经应用于化工，医药转化业等领域，但是工业生产所需要的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾长久以来一直制约着酶技术的发展和应用。因此极端酶作生物催化剂已引起人们关注。目前已得到在极端温度(-2~15度，60~110度)，极端离子强度(2~5mol/LNaCl),或极端PH(4,1)环境中生长的微生物极端酶。但是，极端环境微生物培养条件的严格性或有限的产酶量，限制了极端酶的应用。五、展望近年来随着发酵工程，化学工程，生化工程以及酶工程等技术的发展与综合应用，一些新的方法新的途径受到人们的关注，主要包括：1、把生物转化过程中涉及到的多个酶所对应的基因转移到一种快速繁殖的工程菌细胞中，实现组合生物转化反应和多酶催化的串联生物转化反应。2、将反义基因，内含子，干扰RNA等转入细胞，阻断不需要的mRNA的表达，从而阻止与同样前体竞争的降解酶或酶系的生成。3、用胚胎、骨髓和血液等组织的干细胞、人工脱分化的动物细胞和动物肝细胞等做为生物转化的催化剂来实现高效率生物转化（不易再分化）