免疫学诊断技术

免疫学诊断技术军事医学科学院附属医院陈建魁主要内容：第一节抗原抗体反应第二节免疫学检测常用标记技术第三节免疫细胞的检测第四节免疫分子的检测第五节免疫相关基因的检测第六节免疫学检测方法的应用第一节抗原抗体反应抗原抗体反应:抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。应用已知抗体或抗原检测未知抗原或抗体，可以对感染性、非感染性致病因子或疾病相关因子进行诊断或辅助诊断。1、特异性2、适合比例性3、可逆性抗原抗体反应的特异性：z一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。z抗原抗体结合力的大小，常用亲和力(affinity)或亲合力(avidity)来表示。z亲和力是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度。z亲合力是指整个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。适合比例性：抗体含量抗原含量前带后带等价带在抗原抗体特异性反应时，当抗原与抗体达到昀适比例时，沉淀物形成昀多。如果抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象。出现在抗体过量时，称为前带。在抗原过量时，称为后带。抗原抗体比例合适抗原过剩抗体过剩网格学说（latticetheory）可逆性：Ag+AbK（亲和常数）=AgAb抗原抗体反应的影响因素1、电解质浓度2、酸碱度（pH:6～8）3、温度（37～42℃）抗原抗体反应类型：根据抗原性质、出现结果的现象、参与反应成分的不同，可将抗原抗体反应分为：z凝集反应z沉淀反应z补体参加的反应z采用标记物的抗原抗体反应等颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应(agglutination)。该类反应可检测到ug/ml水平的抗体。1.直接凝集反应细菌或红细胞等颗粒性抗原抗体2.正向间接凝集反应载体颗粒可溶性抗原例如，用γ球蛋白包被的胶乳颗粒,检测病人血清中的抗人γ球蛋白的抗体(类风湿因子)。3.反向间接凝集反应载体颗粒抗体可溶性抗原可溶性抗原(如：血清蛋白质、细胞裂解液等)与相应抗体结合后出现沉淀物，此类反应称为沉淀反应(precipitation)。液相沉淀反应絮状沉淀反应环状沉淀反应++——抗血清抗原抗原抗体免疫比浊法：¾在定量抗体中分别加入不同浓度的抗原，经一定时间后可形成免疫复合物。¾用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，可根据标准曲线计算出样品中的抗原含量。¾该法快速简便，可取代免疫扩散法测定Ig含量。凝胶内沉淀反应免疫扩散技术免疫电泳技术单向扩散试验双向扩散试验火箭电泳对流电泳免疫电泳AgAbAg第二节免疫学检测常用的标记技术免疫标记技术(immunolabellingtechnique)是指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质(胶体金、铁蛋白)作为示踪剂标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。此类方法具有灵敏、特异、快速，能够定性、定量甚至定位测定，结果易于观察、适合自动化检测等很多优点。广泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检测。根据标记物与检测方法不同，标记技术可分为:¾免疫荧光技术¾放射免疫测定¾免疫酶标技术¾发光免疫分析¾免疫金标记技术主要的免疫标记物类别标记物用途荧光素FITC、藻红蛋白（PE）免疫组化免疫分析测定放射性核素3H、51Cr、32P、125I、131I免疫分析测定酶HRP、AP免疫组化免疫分析测定化学发光物Luminol免疫分析测定金属颗粒胶体金免疫组化免疫分析测定用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反应，抗原抗体复合物散发荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。(一)免疫荧光显微技术1直接荧光法：将荧光素直接标记抗体，作标本染色。优点:简便易行。缺点:每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。2间接荧光法：首先用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点:敏感性高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检查。缺点：非特异性荧光容易增多。3补体结合免疫荧光法在抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进行示踪。直接法间接法补体法双标记法(二)流式细胞术(flowcytometry，FCM)免疫荧光技术应用于流式细胞仪,可对细胞的表面标志(抗原或受体)进行快速、精确的分析和自动检测,并可将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)进行多信息分析，是生命科学研究领域广泛应用的一项新技术。(三)荧光免疫测定(fluoroimmunoassay，FIA)1.荧光偏振免疫测定：(fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA)荧光物质经偏振光蓝光照射而跃入激发态，在恢复至基态后可释放出光子，经偏振仪形成偏振光，测定其强度可得到样品中待测物质的浓度。主要用于小分子物质(特别是药物浓度)的测定。2.时间分辨荧光免疫测定(time-resolvedfluoro-immunoassay，TR-FIA)镧系稀土元素具有较长的荧光寿命，用其标记抗原或抗体，并利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可以消除非特异性本底荧光的干扰，所得信号完全是特异荧光，此法灵敏度高、特异性好。3.酶联荧光免疫测定(enzymelinkedfluoro-immunoassay，ELFIA)应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物，经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧光仪进行定量测定。放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)是用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测的技术。将放射性核素的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合,使检测的敏感度达pg/ml水平。常用的放射性核素有125I和131I。常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛等药物以及IgE等。三、免疫酶标技术以酶标记抗体(或抗原)用于免疫学检测，通过酶催化底物显色，对细胞或组织标本中的抗原-抗体复合物进行定位、定性分析；亦可根据酶催化底物显色的深浅程度，定量测定体液中抗原或抗体的含量。(一)酶免疫组织化学技术(enzymeimmunohistochemistry,EIH)通过酶解底物、显色来示踪抗原抗体结合物的存在部位。酶免组化染色标本可在普通光学显微镜下观察，并能长期保存。辣根过氧化物酶的底物二氨基联苯胺(DAB)的分解产物适于电镜观察。常用的方法：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin–biotin-peroxidasecomplex，ABC)，过氧化物酶-抗过氧化物酶法(PAP)和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法(APAAP)。(二)酶免疫测定(enzymeimmunoassay，EIA)1.非均相酶免疫测定(heterogeneousenzymeimmunoassay)根据是否使用固相支持物作为吸附抗体(或抗原)的载体，可分为固相EIA和液相EIA两类方法。其检测的敏感度达ng~pg/ml水平。常用的固相EIA法是酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，此法以聚苯乙烯制品或NC膜等作为固相载体。(1)双抗体夹心法：用于检查特异抗原。首先将已知抗体包被在酶联板上，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相上的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。一般而言，包被抗体和酶标记抗体是识别同一抗原上的不同抗原决定基的2种抗体。(2)间接法：用于检查特异抗体。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。免疫印迹法(Immunoblotting)：它将凝胶电泳与固相免疫结合，是把电泳分区的蛋白质转移至固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。此法能分离不同分子大小的蛋白质并确定其分子量，常用于检测病毒的抗体或抗原。免疫PCR(immuno-PCR，IM-PCR)是将免疫反应的特异性与聚合酶链反应(PCR)的敏感性相结合的免疫学检测技术。★首先用连接分子(如biotin)将DNA分子连接到抗体上；然后与吸附在固相载体上的待测抗原结合，形成抗原-抗体-DNA复合物；然后用特异性引物对DNA进行PCR扩增，检测其扩增产物，可定量测定与DNA标记抗体相对应的抗原。★该法与ELISA基本相似，不同的是用DNA标记代替了酶标记，通过观察PCR扩增产物来判定结果。2.均相酶免疫测定(homogeneousenzymeimmunoassay，HEI)将待测样品、酶标试剂和底物溶液混合，待抗原-抗体反应完成即可直接测定结果，整个检测过程都在均匀的液相中进行。四、发光免疫技术发光免疫测定(luminescenceimmunoassay，LIA)是将发光系统与免疫反应相结合，用于检测抗原或抗体。1.化学发光免疫测定(chemiluminesceneeimmunoassay，CLIA)以化学发光剂(如鲁米诺、吖啶酯等)标记抗体或抗原，免疫反应完成后，直接引发化学发光反应进行检测。2.生物发光免疫测定(bioluminescenceimmunoassay，BLIA)利用生物发光物质(如萤火虫荧光素)或参与生物发光反应的辅助因子(如ATP、NAD等)标记抗原或抗体，利用生物发光反应进行检测。3.化学发光酶免疫测定(chemiluminescenceenzymeimmunoassav，CLEIA):反应步骤与酶免疫测定相同，酶促反应所用的底物为发光剂，通过化学发光反应进行检测。4.电化学发光免疫测定(ECLIA)，该法是在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。电化学发光（electrochemiluminescence，ECL)是在电极表面引发的特异性化学发光反应，包括电化学和化学发光两个过程。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和三丙胺（TPA）在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂。可将TPA氧化成阳离子自由基TPA+*，后者很不稳定，自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA*，这是一种非常强的还原剂。可将三价的[Ru(bpy)3]3+还原成激发态的二价[Ru(bpy)3]2+*。接着激发态的[Ru(bpy)3]2+*衰减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长620nm的光子。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。五、免疫金标记技术免疫金标记技术(immunogoldlabellingtechnique)是以胶体金作为示踪标志物用于抗原抗体反应检测。胶体金标记的抗体可直接用于检测细胞表面和组织切片中的抗原或受体，并可在普通光学显微镜下观察，称为免疫金染色法(immunogoldstaining，IGS)。在IGS的基础上，可用银离子增强免疫金标记技术的敏感性，称为免疫金银染色法(immunogoldsilverstaining，IGSS)。第三节免疫细胞的检测一、免疫细胞的分离与纯化(一)白细胞的分离血液中红细胞与白细胞的比例约为600～1000:1，两类细胞比重(密度)不同，沉降速度各异，可采用下述方法分离。1.自然沉降法:采用肝素抗凝静脉血，由于红细胞的沉降率较快，可使白细胞与之分离。2.高分子聚合物加速沉降法某些高分子聚合物(如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等)可使红细胞呈钱串状凝聚，加速其沉降，从而更易与白细胞分离。(二)外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)指淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.075～1.090；红细胞和多核白细胞的密度为1.092左右；血小板为1.030～1.035。因此，利用等渗溶液进行密度梯度离心，可分离不同类别的细胞。1.聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque，F-H)法：将聚蔗糖和泛影葡胺配制成密度为1.077的分层液，将肝素抗凝血加在分层液上，离