1.xls 基因工程的基本操作程序

步骤一：目的基因的获取目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，植物的抗逆性相关的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。从已有的物种中分离人工方法合成从基因文库获得基因组文库部分基因文库利用PCR技术扩增DNA合成仪用化学方法直接人工合成（基因小、核苷酸已知）1、从基因文库中获取目的基因基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库(genelibrary)。基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库叫做基因组文库。部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）真核生物cDNA文库与的区别基因组文库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少种间的基因交流小大无有无有某种生物部分基因某种生物全部基因可以部分基因可以2、利用PCR技术扩增目的基因聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。循环（重复）变性退火延伸使目的基因短时间内成百万倍地扩增PCR技术的原理：DNA复制(体外)过程：变性退火延伸（解链为单链）（冷却）（子链合成）条件：①引物（2种）；②模板:DNA的两条链；③四种脱氧核苷酸；④热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。多次重复PCR技术与DNA体内复制的区别：DNA复制(体内）PCR技术引物解旋酶操作环境需要需要常温条件、解旋酶、ATP高温条件（90~95℃）DNA解旋酶、DNA聚合酶、耐高温的Taq酶体内（细胞内）体外练习．有关PCR技术的说法，不正确的是(）A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B．PCR技术的原理是DNA双链复制C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列D．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNAＤ（1）催化①过程的酶是___________。（2）③过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达90~95℃时才能完成，说明DNA分子具有__________性。（3）由图中信息分析可知，催化②⑤过程的酶都是__________，两者在作用特性上的区别是___________。（4）如果RNA单链中有碱基100个，其中A占25%，U占15%，则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶______个。70～75℃RNA单链杂交双链RNA链DNA链①核酸酶H单链DNA②双链DNA90～95℃③55～60℃④⑤反转录酶（或逆转录酶）练习：1970年，特明和巴尔的摩证实了RNA病毒能依赖RNA合成DNA的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题：稳定DNA聚合酶催化⑤过程的酶耐高温60蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成3.通过DNA合成仪化学方法直接人工合成（基因比较小、核苷酸序列又已知）步骤二：基因表达载体的构建（核心内容）获取目的基因同一种限制酶切割DNA连接酶产生相同的末端重组DNA1.表达载体的构建过程CTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGGGAATTC质粒目的基因与运载体结合的过程实际上是不同来源的基因重组的过程。步骤二：基因表达载体的构建（核心内容）2.表达载体的组成启动子：+目的基因：+终止子：标记基因：+是的结合位点，驱动过程。RNA聚合酶转录终止过程。转录有目的基因的受体细胞。鉴定和筛选编码人类所需的蛋白质,使生物表达相应性状.复制原点：启动复制质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端基因表达载体的组成复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因1.上述表达载体的启动子、目的基因、终止子、标记基因的化学成分相同吗？都是DNA2.终止子和终止密码的化学成分是否一致？终止子——DNA,终止转录;终止密码——RNA上，终止翻译.3.图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答：（1）将含有目的基因的DNA与质粒该表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用ＤＮＡ连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有、、三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行.（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是；目的基因－运载体连接物运载体－运载体连接物目的基因－目的基因连接物分离纯化目的基因－运载体连接物运载体－运载体连接物练习.图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是，其合成的产物是。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是。EcoRI和BamHI启动子mRNA•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。•将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。步骤三：目的基因导入受体细胞转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。转化1.将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法：感染双子叶植物和裸子植物，对大多单子叶植物没有感染力；（2）基因枪法：常用于单子叶植物；（3）花粉管通道法：转基因抗虫棉。（2）基因枪法：常用于单子叶植物；花的结构示意图123456789花柄花托子房花萼花瓣花柱柱头花药花丝雄蕊雌蕊（花冠）（3）花粉管通道法：转基因抗虫棉。2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。3.将目的基因导入微生物细胞导入大肠杆菌的方法:首先用Ca2+处理细胞，以增大细菌细胞壁的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态——感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。显微注射技术提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植1、检测与鉴定的目的目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性。步骤四：目的基因的检测与鉴定2、分子水平的检测检测是否插入了目的基因检测是否转录出了mRNA检测是否翻译成蛋白质3、个体生物学水平的检测——做抗虫或抗病的接种实验——抗原--抗体杂交——DNA分子杂交技术——DNA--RNA分子杂交技术不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。•受体细胞摄入DNA分子后，就说明目的基因完成了表达吗？若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定1.以下说法正确的是（）A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B.质粒是基因工程中唯一的运载体C.运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D.基因控制的性状都能在后代表现出来2.有关基因工程的叙述中，错误的是（）A.DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B.限制性核酸内切酶用于目的基因的获得C.目的基因须由运载体导入受体细胞D.人工合成目的基因不用限制性核酸内切酶C练习A3.在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得A.人的胰岛素基因B.蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基因D.菜豆储藏蛋白基因CD4.不属于质粒被选为基因运载体的理由是（）A.能复制B.有多个限制酶切点C.具有标记基因D.它是环状DNA5.有关基因工程的叙述正确的是（）A.限制酶只在获得目的基因时才用B.重组质粒的形成在细胞内完成C.质粒都可作为运载体D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料6.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A.人工合成目的基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达DC