基因工程的基本操作程序

复习•1.基因工程中基本工具有哪些？•2.基本工具的作用和特点分别是什么？•3.限制酶、DNA连接酶分别作用于DNA的什么部位？•4.基因工程的基本步骤是什么？•5.获得目的基因的方式有哪些？目的基因1．质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点是：()①能自主复制②不能自主复制③结构很小④蛋白质⑤环状RNA⑥环状DNA⑦能“友好”地“借居”A．①③⑤⑦B．②④⑥C．①③⑥⑦D．②③⑥⑦C2．下列不是基因载体必须具备的条件的是()A、能自我复制B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD真核生物的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点前体信使RNA成熟的信使RNA第二节基因工程的基本操作程序（一）获得目的基因（二）构建基因表达载体——形成重组DNA分子（三）将目的基因导入受体细胞（四）目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序用DNA合成仪人工合成利用PCR技术扩增已知序列：从基因文库获得未知序列：（一）目的基因的获取：目的基因即我们所需要的基因。基因组文库：含某种生物的全部基因部分基因文库：含某种生物的部分基因（如cDNA文库）•cDNA文库•基因组文库从基因文库中获取目的基因鸟枪法：散弹射击法供体细胞DNA限制酶许多DNA片段载入载体导入受体细菌扩增产生特定性状分离目的基因•构建基因组文库并获得目的基因：基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。目的基因的mRNA逆转录单链DNA合成双链DNA（目的基因）•逆转录法构建cDNA文库并获得目的基因载入载体导入受体细菌扩增产生特定性状分离目的基因蛋白质氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测结构基因的核苷酸序列（单链）•根据已知氨基酸序列直接合成DNA•化学合成——人工合成•核苷酸序列已知，把将要合成的DNA序列输入到DNA合成仪，用化学方法直接人工合成聚合酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)KaryB.MullisPCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。PCR的反应体系模板：DNA原料：四种脱氧核苷酸；酶：Taq酶（TaqDNA聚合酶）嗜热细菌中分离得到引物：DNA片段Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液：维持PH恒定，保护Taq酶PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸1．变性双链模板DNA解离为单链结构。（90～95℃）DNA双链DNA单链变性2．退火引物与模板互补成双链。（55～60℃）(由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。)PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸引物PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸3．延伸在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。70～75℃延伸变性第二次循环退火第二次循环延伸第二次循环㈡PCR反应曲线理论上，PCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增25-30个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。PCR仪程序设定PCR的应用•PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。实例1：•1、下列获取目的基因的方法中需要模板链是（）•A.从基因文库中获取目的基因•B.利用PCR技术扩增目的基因•C.反转录法•D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成（二）基因表达载体的构建—形成重组DNA分子切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？同一种目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等㈣将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。导入方式：（三）将重组DNA分子导入受体细胞导入微生物细胞将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1)获得目的基因和质粒载体；2)形成重组质粒；3)制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4)培养大肠杆菌，让重组质粒形成大量拷贝；5)筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞。导入植物细胞：土壤农杆菌转化法土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物和裸子植物基因枪法：单子叶植物常用的一种基因转化方法，但成本较高。花粉管通道法：十分简便经济的方法。我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：重组DNA提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育新性状动物转基因动物1.筛选含有目的基因的受体细胞通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。（1）抗药性筛选法：菌株为某种抗生素缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如抗氨苄青霉素，抗卡拉霉素等）。如何筛选出含有目的基因的受体细胞？（这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。）（四）目的基因的检测与鉴定pBR322质粒结构如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活标记基因进行筛选限制性内切酶识别序列外源基因连接PStⅠPStⅠ自主复制（2）DNA分子杂交——检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA②用含目的基因的DNA片段（单链）用放射性同位素等作标记,以此做探针③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中过程:利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆检测方法：DNA分子杂交技术DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。2.检测目的基因的表达检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质目的基因成功表达的标志——体现特定性状检测性状（3）鉴定（个体生物学水平）：（1）检测目的基因是否转录出了mRNA（2）检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原—抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA回答问题：1、基因工程的别名：2、操作环境：3、操作对象：4、操作水平：5、基本过程：6、结果：基因拼接技术或重组DNA技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物或新的性状思考：β—珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β—珠蛋白，想一想，应如何进行设计？