基因工程的基本操作程序(精华)

基因工程基本操作的四个步骤：第一步：目的基因的获取第二步：基因表达载体的构建第三步：将目的基因导入受体细胞第四步：目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。补充：基因的结构编码区非编码区编码区上游非编码区编码区下游启动子终止子(1)原核基因的结构：与RNA聚合酶结合位点转录起点转录终点终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录编码蛋白质(编码序列)调控遗传信息的表达(调控序列)启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。补充：基因的结构(2)真核基因的结构：转录mRNA前体翻译肽链内含子外显子编码区非编码区非编码区启动子终止子加工成熟mRNA一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。2.获取方法：(1)从基因文库中获取：①基因文库：——将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。②基因文库的分类：按外源DNA片段的来源分类基因组文库：部分基因文库：含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。2.获取方法：(1)从基因文库中获取：③获取目的基因的根据：——根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。④建立基因文库的目的：——为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。(1)从基因文库中获取：⑤基因文库的构建：基因组文库的构建：直接分离法(鸟枪法)提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库注意：基因文库的组建过程就包含了基因工程的步骤。目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞(1)从基因文库中获取：⑤基因文库的构建：cDNA文库的构建：反转录法某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反(逆)转录酶DNA聚合酶(1)从基因文库中获取：⑤基因文库的构建：基因组文库和cDNA文库的区别：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。2.获取方法：(1)从基因文库中获取：⑥从基因文库中获取目的基因的优点：——操作简便。⑦从基因文库中获取目的基因的缺点：——工作量大，具有一定的盲目性。一、目的基因的获取2.获取方法：(2)利用PCR技术扩增目的基因：①什么是PCR？——PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。②PCR的原理：——利用DNA双链复制的原理。③条件：——要有一段已知目的基因的核苷酸序列【前提条件】、四种脱氧核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)等。(2)利用PCR技术扩增目的基因：④过程：脱氧胞苷三磷酸脱氧腺苷三磷酸脱氧鸟苷三磷酸脱氧胸苷三磷酸(2)利用PCR技术扩增目的基因：④过程：A.变性(90℃-95℃)：——双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。B.退火(55℃-65℃)：——系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。C.延伸(70℃-75℃)：——在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。D.多次重复：一、目的基因的获取2.获取方法：(2)利用PCR技术扩增目的基因：⑤方式：——以指数方式扩增，即2n(n为扩增循环的次数)。⑥PCR技术扩增与DNA复制的比较：PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子2.获取方法：(2)利用PCR技术扩增目的基因：一、目的基因的获取2.获取方法：(3)化学方法人工合成：——如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。一、目的基因的获取练一练：1.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是()A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高C一、目的基因的获取练一练：2.获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是()A．从基因组文库中获取B．从cDNA文库中获取C．从含目的基因生物细胞中获取D．利用PCR技术获取C3.PCR技术扩增DNA，需要的条件是()①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A．①②③④B．②③④⑤C．①③④⑤D．①②③⑥A一、目的基因的获取练一练：4.有关基因工程的叙述正确的是()A．限制酶只在获取目的基因时才用B．重组质粒的形成是在细胞内完成的C．质粒都可以作为运载体D．蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索D5.在基因工程技术中，下列方法与目的基因获得无关的是()A．辐射诱变法B．从基因文库中获取C．反转录法D．人工合成法A一、目的基因的获取练一练：6.下列关于基因工程的说法中，正确的是()A．基因工程的设计和施工都是在细胞水平上进行的B．目前基因工程所有的目的基因都是从供体细胞中直接分离得到的C．只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功进行表达D．基因工程能使科学家打破物种界限，定向改造生物性状D一、目的基因的获取练一练：7.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③D二、基因表达载体的构建1.构建目的：——使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因二、基因表达载体的构建1.构建目的：——使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成：想一想：启动子、终止子和标记基因分别有什么作用？启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。二、基因表达载体的构建3.构建表达载体：同一种限制酶载体(如质粒)DNA分子(含目的基因)一个切口两个黏性末端两个切口(两个黏性末端)的目的基因基因表达载体(如重组质粒)DNA连接酶二、基因表达载体的构建3.构建表达载体：(1)用一定的_______切割质粒，使其出现一个切口，露出________。(2)用_____________切断目的基因，使其产生________________。(3)将切下的目的基因片段插入质粒的____处，黏性末端因_________________而相连，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)。限制酶黏性末端同一种限制酶切口碱基互补配对原则相同的黏性末端DNA连接酶二、基因表达载体的构建3.构建表达载体：特别提醒：(1)用限制酶切割载体和含目的基因的DNA分子时，可以使用不同的限制性核酸内切酶,但是必须切出相同黏性末端。(2)不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具有相同的结构和化学组成，都是双螺旋结构，都由四种脱氧核糖核苷酸组成，都遵循相同的碱基互补配对原则：A—T，G—C。(3)目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。二、基因表达载体的构建练一练：1.如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是()A．基因工程的核心步骤是基因表达载体构建B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因B二、基因表达载体的构建练一练：2.下列操作中不属于基因表达载体构建过程的是()A.用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端B.用同一种限制酶切割目的基因露出黏性末端C.将切下的目的基因片段插入质粒切口处D.将重组DNA导入受体细胞中D3.下列哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子B.终止子C.标记基因D.复制原点D二、基因表达载体的构建练一练：4.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是()A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A三、将目的基因导入受体细胞1.什么是转化？——目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的受体细胞：——大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。3.将目的基因导入受体细胞的原理：——借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：①适用范围：(1)农杆菌转化法：——双子叶植物和裸子植物。小知识：植物的分类依据是否形成种子种子植物裸子植物：松、杉、柏、银杏被子植物双子叶植物：花生、大豆单子叶植物：水稻、玉米孢子植物藻类植物：衣藻、水绵、海带苔藓植物：葫芦藓、地钱蕨类植物：肾厥、满江红三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：②农杆菌特点：(1)农杆菌转化法：——在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：③转化过程：(1)农杆菌转化法：三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：(2)基因枪法：适用范围：——适用于单子叶植物，但成本较高。三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：(3)花粉管通道法：适用范围：——适用于被子植物，且十分简便经济。胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊三、将目的基因导入受体细胞5.将目的基因导入动物细胞：(1)导入方法：——显微注射法。(2)过程：——目的基因表达载体提纯→从雌性动物内取出卵(卵在体内或体外受精)并进行显微注射→含目的基因的受精卵→胚胎早期培养至囊胚期再移植到雌性动物输卵管或子宫，使其发育成具有新性状的动物。三、将目的基因导入受体细胞6.将目的基因导入微生物：(1)原核生物特点：——繁殖快、单细胞、遗传物质少。(2)方法：——用Ca2+处理细胞→感受态细胞表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。三、将目的基因导入受体细胞知识拓展：(1)不同生物的受体细胞不同：植物一般为体细胞(也可以受精卵)，动物一般为受精卵，微生物一般为大肠杆菌。(2)上图中发生②与发生①相比，②会