感受态细胞和质粒DNA的转化(C)

感受态细胞和质粒DNA的转化重组DNA分子导入受体细胞导入大肠杆菌:氯化钙转化法electroporation电击法又叫电穿孔法体外包装感染法重组DNA导入哺乳动物细胞:DNA-磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染法脂质体介导法、原生质体融合法酵母菌转化法:完整细胞转化法原生质体转化法电击法大肠杆菌(Escherichiacoli)大肠杆菌(Escherichiacoli)大约含3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度37℃，PH7.0～7.6(一般7.4)，保存加甘油，培养皿密封。大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期(生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、稳定期(饱和期)，约1×109~2×108/mL和衰老期。大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株比大肠杆菌X1776株保存期长。所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。2.菌株的保存①LB琼脂平板划线，37℃，倒置平板培养(16-24hr)，形成单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔绝空气)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。E.coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中，4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。②穿刺琼脂(stabagar)，室温，避光可保存数年。③冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入10-50%甘油培养基中，分装，置-20～-70℃。可经过30次冻融，细菌仍然存活。菌LB中过液培养，加入等体积2×冰冻培养基。液氮速冻后置-70℃，可经15次冻融，保存5年以上。具体保存方法：琼脂穿刺培养基2×冰冻培养基琼脂（Difco）6gK2HPO412.6g细菌胰蛋白胨（Difco）10gN++-柠檬酸0.19gNaCl8gMgSO4＞H2O0.18gHCl20mg(NH4)2SO41.8gddH2O至1LKH2PO43.6g甘油88gdH2O至1L菌株保存液的配制高压灭菌Phagemid-20℃Enzyme-20℃Buffers-20℃Primer-4℃Thiodeyivatives-20℃Ribonucleotides-20℃Helperphage-4℃置于—20℃或—80℃，并一个月检查一次抗生素工作浓度松驰型质粒严紧型质粒氨苄青霉素(Amp)50mg/mL（水）60ug/mL20ug/mL氯霉素(Cm)34mg/mL（乙醇）170ug/mL25ug/mL卡那霉素(Kan)50ug/mL（水）50ug/mL10ug/mL链霉素(Sm)10mg/mL（水）50ug/mL10ug/mL四环素(Tc)5mg/mL（乙醇）50ug/mL10ug/mL抗生素的配制大肠杆菌感受态细胞制备和贮存在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆菌缺乏天然的转化机理。1970年M.Mandela和A.Higa提出，在转化DNA之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌，能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆菌的转化频率。目前对这种机制尚不清楚。感受态细胞(Compenentcells)：将质粒DNA或重组质粒DNA转化到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。(主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法)①取出大肠杆菌HB101菌种管划LB琼脂平板，-70℃保存，37℃过夜(一般16小时)。②取一个菌落接种于3~5mlLB培养管中，37℃振培养，过夜(8~16小时)。③取出1mL过液菌加入新鲜配制的LB培养液50mL中(2%接种量)。37℃振荡培养，2~4小时。测定光密度值(约5×107个细胞/mL)，OD550达0.3~0.5。注意：不同的大肠杆菌菌株，每mL培养物中细菌存活数与光密度值间关系不同。HB101，OD600=0.5（约×107个细胞/mL）X1776，OD600=0.2（约×107个细胞/mL）④细菌培养管取出置水浴中，10~15分钟。⑤细菌移入预冷的离心管中，4℃4000GSA转头，转离心5分钟；弃上清，留沉淀置于冰浴中。⑥加0.1mol/LCaCl2(预冷)溶液25mL，将沉淀充分悬浮，置冰浴中20~30分钟。延长CaCl2处理时间，可增加感受态，所以也可在0℃过夜。⑦4℃，4000~2500rpm转离心5分钟，弃上清，留沉淀，置冰浴中。⑧用预冷的0.1mol/LCaCl2溶液2.5mL，小心轻轻悬浮沉淀，4℃过夜。可直接使用。⑨次日加20%(最终浓度)灭菌预冷甘油。⑩分装成每Eppendorf管200uL。新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受态细胞0℃~4℃贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在-70℃干冰或液氮气体部分速冻5分钟，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。①CaCl2处理4℃，0.1M低渗CaCl2处理使细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，俗称“打孔”，使DNA分子能够进入细胞内。②CaCl2处理使感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。在细菌中能发展为感受态细胞占极小数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来DNA分子。保持感受态的时间约1~2天，一般出现在生长对数期的后期。两种假设：5.DNA转化感受态细胞抗生素抽滤除菌并均置-20℃保存。抗生素不耐热，在加入到琼脂板中时，应等琼脂冷至48~50℃时再加入抗生素Mg++是四环素拮抗物，需加MgCl2时改加NaCl(6g/L)四环素光敏感应避光保存（1）抗性琼脂板中抗生素的配制①感受态细胞新鲜配制的或从-80℃冻存取出后置于冰水中融化。②取出分装到Eppendorf管中，每管100~200uL。③加入需转化的DNA溶液25ul充分混匀(1~5ug/mLDNA)。④冰水中放置30分钟。⑤37℃或42℃水浴2分钟。(热休克)⑥冰浴2min。⑦每管再加入1mLLB培养基，37℃振荡培养1小时。⑧取出后稍加离心，去掉部分上清，留500uL或250mLLB则全部铺板。（2）转化步骤⑨取100~200uL，置于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻璃棒涂匀；静置5~10分钟。⑩倒置37℃培养12~18小时(一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增，提取DNA酶切，电泳检测，筛选重组子。并设下列对照：A．不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。B．用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。DNA超螺旋转化最好DNA环状次之DNA线状有干扰作用1ugpBR322DNA转化入HB101可得：5×106/2×107转化子。DNA分子量小比分了量大的转化率高，一般不超过10kb，最高限为15kb。一般1ugDNA可得5×107~1×108个转化菌。（3）注意事项①宿主菌取出时应注意菌株名及编号。②检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。③整个操作过程应保持无菌状态。④LB培养液中不能有抗生素。⑤不同受体菌，培养要求不同。如K802株，OD550=0.5最好，而X1776株，OD550=0.2~0.3最好。质粒的DNA比较小，有助于其转于宿主细胞中的效率。转化效率与质粒大小成反比。而质粒大于15kb时，转化率成为限制因素。同时质粒大，复制的拷贝数低。（4）质粒的三种构型①超螺旋闭合环状DNA，cccDNA。②开环DNA，至少一股DNA上有缺口，一处或多处使DNA鲜旋。③线状DNA琼脂糖(Agrose)电泳可将这三种构型的DNA分开，Agrose电泳中cccDNA位置最前。二、阅读微生物的基因型符号在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表现型。基因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映的是可观察到的特性。1．由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在描述一个品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给出的是这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，trp、his和metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突变了的，其他基因组仍然正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基因(如trp)时，可以用trp+，或者只是简单地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到它时都写作trp+。有些突变型是缺失突变，就用△表示，如△lon表示lon基因的缺失突变。2．有些细菌中有附加体或者其他特殊的传导噬菌体。最常见的是性因子F。细菌中有F因子的描述为F+；没有的为F-。有些F因子上面带有细菌的某些基因，这样的F因子写作Fˊ，它所带基因的描述方法同上。例如Flac+，proA+，B+表示F因子上面带有细菌的lac和proA，B基因。又如，FlacZ，proA+，B+表示F因子上面带有lac和proA，B基因，但是，其中的Z基因是突变的基因。3．校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花缭乱。因为野生型品系虽然不带有校正基因，它的基因型却理所当然地应当写作sup+，表现型则应该写为Sup-。可是，带有sup基因的突变型品系的基因型必需写为sup-或者sup，它的表现型是Sup+。也就是说，字面上的概念与实际上的情况正好倒了一个个儿。因此，在阅读它时要特别小心，以免搞错。此外，在谈到特殊的校正基因时，它的表现型常用数字来表示，如Sul；但是，它的基因型却用字母来表示supD。鉴于这种情况，有人建议对校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符号，只标出突变型品系(Su+)的特殊基因座位符号，如supD和supE等。JM83，F-，ara，△(lac-proAB)，rpsL，Ф80d，lacZ△M15是这样一个品系：不带F因子，ara基因座突变(因此不能代谢阿拉伯糖)，lac操纵子缺失(因此不能利用乳糖)，30S核糖体的S12亚基突变(因此有链霉素抗生)，β-D-半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含X-gal的平板中有α-互补作用。如果将克隆的pUC质粒的重组DNA转化入这个细菌，就可以通过蓝/白菌斑来筛选出转化子)。野生的大肠杆菌具有大约4700kbp的DNA分子，上面有约2800个基因。当这些基因中有突然变异发生时，基因产物随之变化，并且有可能给大肠杆菌带来可以观察到的变化。这种能够观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，而把基因的构成叫做大肠杆菌的基因型(Genotype)。试举一例来说明上述概念：通常情况下，基因工程中使用的大肠杆菌的基因型只有在基因发生变异，表现型发生变化时才被表示。但是需要特别的表示时，则在野生的基因型上加“+”，在变异的基因型上加“-”以示区别。表示方法是用基因产物或其作用的名称的三个斜体字素表示(如DNAAedninemethylase-dam)。如果不同的基因变导致相同的作用结果，则加上一个大写字母(如Recombination-recA、recB、recC)。某个基因或者是某领域缺失时，在基因型前向加上“△”表示，如“从lac到proAB基因缺失时表示为△(lac-proAB)。野生的大肠杆菌本来还有具有F因子等的质粒DNA，并且感染噬菌体。把被野生的大肠杆菌感染的噬菌体特称为原噬菌体(Prophage)，例如e14。一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用“()”或“/”等加以区别表示。表现型是用罗马字母体表示(第一个字母大写)。一般通过变异而获得了能够观察到的抗药性或者活性表达等特征时，用“+”表示(Steptomycin抗性：Str+)；相反地当成为药物敏感性或者活性丧失时，用“-”表示(