分子诊断学_复杂性疾病的分子诊断

Chapter16遗传性疾病的分子诊断1.Molecularpathologyrepresentstheapplicationoftheprinciplesofbasicmolecularbiologytotheinvestigationofhumandiseaseprocesses.molecularpathology：分子病理学KeyPoints2.Genemutationand/orgeneticpolymorphismisanormaloccurrence,usuallywithoutgraveconsequences,thatcontributestothosetraitsthatestablishourindividuality.geneticpolymorphism：基因多态性3.Accordingtonumerousinformationavailable,geneticdiseasescanbecategorizedintothreemajorgroups:chromosomaldisorders,monogenicorsingle-genedisorders,andpolygenicormultifactorialdisorders.chromosomal：染色体；monogenic/single-gene：单基因；polygenic/multifactorial多基因4.Polygenicormultifactorialdisordersresultfrommultiplegeneticand/orepigeneticfactorsthatdonotconformtotraditionalMendelianinheritancepattens,whicharedifferentinmonogenicdisorders.epigenetic：后生的；Mendelianinheritance：孟德尔遗传；5.Thepathogenicnatureofmethylationisillustratedbytheobservationthatformanytumorsuppressorgenes.methylation：甲基化；pathogenic：病原的Hybridization：杂交6.ThedetectionofmethylatedsequencesinDNAderivedfromtheplasmaorserumbyallkindsofsensitivetechniquesisapotentiallyimportantearlydetectionandmonitoringmethodforcancer.plasmaorserum：血浆或血清potentially：潜在地7.DNAalterationshavebeendetectedinpatientswithsmalloreveninsitulesions,indicatingthattumorDNAisshedintocirculationearlyinthedisease.alterations：改变，更改；insitu：在原来的位置；lesion：机能障碍；8.Oureverbroadeninginsightsintothemolecularbasisofdiseaseprocessescontinuetoprovideanopportunityfortheclinicallaboratorytodevelopandimplementnewandnovelapproachesfordiagnosis,monitoring,drugresistanceandprognosticassessmentofhumandiseases.Implement：实施；prognostic：预兆复杂性疾病包括肿瘤（tumor）、心血管疾病（cardiovasculardiseases）、自身免疫性疾病（autoimmunediseases）和一些代谢性疾病（metabolicdiseases）等。肿瘤（tumor）：医学术语亦称恶性肿瘤（malignantneoplasm），由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。分子生物学的研究已经发现2.5万多种与癌症相关的基因变异，这个数字还在增加心血管疾病（cardiovasculardiseases）：心血管疾病是威胁人类健康的最常见疾病，其发病率在中国居于首位。自身免疫性疾病（autoimmunediseases）：是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。代谢性疾病（metabolicdiseases）营养物质进入机体后在体内合成和分解代谢过程中的一系列化学反应，如某一环节出现障碍则引起代谢性疾病Section1复杂性疾病的分子诊断策略一．复杂性疾病分子诊断的定义和原理复杂性疾病（complicateddiseases）基本特征：发病原因不明，由多个基因和环境因素共同参与，不符合孟德尔遗传规律，当出现典型临床表现时已经处于病程的中后期。复杂性疾病分子诊断的特点：1.直接检测疾病或疾病相关基因，属病因诊断，针对性强。2.特异性强，灵敏度高。3.适用范围广。二．复杂性疾病分子诊断常用的检测标本患者的外周血细胞病灶局部的受损组织血浆DNA血浆DNA（plasmaDNA），又称循环DNA（circulatingDNA），是一种无细胞状态的胞外DNA，由长度不等的单链或双链DNA组成。根据核苷酸序列的组成差异性，可分为：①人类基因组来源的循环DNA；②细菌及病毒等病原生物来源的循环DNA人类基因组循环DNA来源于：①细胞死亡后释放的DNA片段；②细胞主动分泌或释放的DNA片段三．分子诊断的常用方法与思路分子杂交（molecularhybridization）不同来源或不同种类生物分子间相互特异识别而发生的结合。如核酸(DNA、RNA)之间、蛋白质分子之间、核酸与蛋白质分子之间、以及自组装单分子膜之间的特异性结合。PCR（polymerasechainreaction）DNA序列分析基因芯片1.基因结构异常检测：①斑点杂交（dotblothybridization）②等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（allele-specificoligonucleotide,ASO）③单链构象多态性（SSCP）④限制性内切酶图谱（restrictionmap）⑤限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）⑥DNA印迹（Southernblot）2.基因转录水平检测：①RNA印迹（Northernblot）②逆转录PCR（RT-PCR）3.基因序列分析及表达检测技术①DNA序列分析②基因芯片Section2肿瘤的分子诊断基因和蛋白质水平改变，其发生发展存在一定的遗传学基础，以此作为肿瘤分子诊断的依据一．肿瘤的发病机制1.阶梯式遗传学疾病2.表观遗传学改变Classicalgenetics表观遗传学研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传变化的，或者说是研究从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴的遗传学分支。表观遗传所谓表观遗传就是不基于DNA差异的核酸遗传。即细胞分裂过程中，DNA序列不变的前提下，全基因组的基因表达调控所决定的表型遗传，涉及染色质重编程、整体的基因表达调控（如隔离子，增强子，弱化子，DNA甲基化，组蛋白修饰等功能),及基因型对表型的决定作用。•表观遗传学的研究内容：基因转录后的调控基因组中非编码RNA微小RNA（miRNA）反义RNA内含子、核糖开关等基因选择性转录表达的调控DNA甲基化基因印迹组蛋白共价修饰染色质重塑组蛋白修饰2染色质重塑3RNA调控4DNA甲基化1DNA甲基化(methylation)DNA甲基化一般与基因的沉默(genesilence)相关，非甲基化(non-methylation)一般则与基因的活化(geneactivation)相关，而去甲基化(demethylation)往往是与一个沉默基因的重新激活(reactivation)相关DNA甲基化对维持染色体的结构具有重要作用，并且与X染色体的失活、基因印迹和肿瘤的发生密切相关。3.基因变异基因异常表达肿瘤因此可以将特定肿瘤的基因表达标记，应用到肿瘤诊断、分型和对治疗反应性的预测当中。A.癌基因（oncogene）：能引起细胞恶性转化的基因原癌基因（pro-oncogene）或细胞癌基因（c-onc）按照癌基因编码蛋白的结构和功能及其在细胞内的定位，癌基因可以分为五大类：①生长因子类②酪氨酸激酶类③GTP结合蛋白类④核蛋白类⑤端粒酶（telomerase）P264B.癌基因的活化机制：①转导：漫长的生物进化过程中，正常基因整合癌基因②点突变③插入突变④易位⑤基因扩增⑥基因甲基化改变C.抑癌基因：一对等位基因由于其功能的丧失，从而使细胞过度生长增殖，导致肿瘤形成。这一对等位基因即为抑癌基因。主要包括两个方面：①抑癌基因必须是一对等位基因同时是失活的；②wild-type导入到肿瘤细胞，体外培养可以抑制细胞增殖常见的抑癌基因：Rb基因、p53基因、APC基因、BRCA1基因、WT1基因、erbA基因、INK4基因、p21clip1基因3.基因变异4.DNA损伤及其分子改变5.基因组不稳定性6.染色体异常7.微卫星不稳定性二．肿瘤早期分子诊断及预后1.肿瘤早期诊断的策略：考虑因素：①特殊类型肿瘤的靶基因；②不同肿瘤特定靶基因的突变谱；③共检测使用的合适样本；④分子诊断技术的敏感性I.检测标本的选择：多选择含有患者肿瘤细胞来源基因信息的体液、分泌物或排泄物作为临床肿瘤分子诊断的检测样本，如血、痰及大便等II.检测样本的处理：①重复离心法：EDTA抗凝血→4℃1500r/mincentrifuge20min→上层血浆3000r/mincentrifuge10min，吸取上清，弃去沉淀，得到的液体即为无细胞血浆，置-70℃保存备用②蛋白酶K-酚/氯仿抽提法③磁珠法④QIAampDNAminikit(超链接)2.肺癌的早期分子检测：甲基化特异性引物基因扩增（methylationspecificPCR,MSP）、甲基化特异性序列分析（methylationspecificsequencing,MSS）Section3原发性高血压