第6章 LD50计算

急性毒性试验方法统计分析软件河南农业大学牧医工程学院潘玉善急性毒性试验方法LD50的测定一个世纪以前尽管已有急性毒性试验，但很不规范；1927年Trevan详细描述LD50测定法，急毒试验开始正规化；1931年Karber按面积法原理推出寇式计算法，即寇氏法；1934年Bliss等人得出可求得动物任何死亡率的致死量，即Bliss法；后来人们有得出许多简便计算方法：如简化机率单位法、目测画图法、序贯法、孙氏改良寇式法(1963)等方法。随着计算机的普及，现有编好的Bliss程序，Bliss法已成为最常用的急毒试验方法。概述急性毒性试验方法LD50的计算LD50的测定是以动物死活为指标的质反应，当死亡呈正态分配时，一般具有以下特点：剂量对数值与死亡率之间为“S”型曲线；剂量对数值与概率单位之间为直线关系；从实验数据可计算LD50以外的其它信息。急性毒性试验方法S形曲线0255075100反应率（%）剂量图2-1剂量-反应曲线（对称S形曲线）急性毒性试验方法abc50x-s-2s+s+2s剂量死亡频率%死亡率%概率单位84.115.9图2-2S形剂量-反应曲线向直线的转换5101520103050709034567急性毒性试验方法一、改良寇氏（Kärber）法实验设计要求：（1）各组剂量按等比级数（常按1.2～1.5）设计（2）各组试验动物数必须相等；急性毒性试验方法一、改良寇氏（Kärber）法（3）试验动物对受试物的反应情况大致符合正态分布（剂量对数浓度对死亡频率），即要求大致有一半的组所产生的反应率在（10%～50%，另一半的组所产生的反应在50%～90%，最好还含有反应率为0%及100%的组，所以要求预试。急性毒性试验方法试验步骤：（1）预试确定Dn（LD0，0％死亡）及Dm（LD100，100％死亡），（2）确定剂量公比；（3）根据r确定各组染毒剂量；（4）记录统计死亡率，代入公式计算，当不含0％，100％死亡率时用校正公式。急性毒性试验方法)]43([log150∑−−−−=−nmmPPpiXLD)]5.0([log150∑−−=−piXLDm∑=npqiS50x校正公式急性毒性试验方法i—组距，即相邻两组对数剂量之差Xm—最大剂量对数P—各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示)Pm—最高死亡率q—各组剂量存活率，q=1-pPn—最低死亡率∑p—各剂量组死亡率之和n—各组动物数Sx50—logLD50的标准误急性毒性试验方法LD50的95%可信限计算公式LD50的95%可信限=log-1(logLD50±1.96×Sx50)急性毒性试验方法九灵胃康在小鼠的经口急性毒性试验结果急性毒性试验方法kggpiXLDm/29.46329.0log)]5.08.2(11.08859.0[log)]5.0([log11150==−−=−−=−−−∑急性毒性试验方法0307.01016.01025.01021.01016.011.050=+++==∑npqiSx急性毒性试验方法LD50的95%可信限=log-1（logLD50±1.96×Sx50）=log-1（0.6329±1.96×0.0307)=log-1（0.6329±0.0602)=3.74~4.93g/kg小鼠的经口LD50为4.29g/kg95%可信范围为3.74~4.93g/kg。急性毒性试验方法二、概率单位法九灵胃康在小鼠的经口急性毒性试验结果1085320死亡数(n)101010101010动物数(n)654321组别7.695.924.553.502.692.07剂量g/kg急性毒性试验方法SASv6.12SASv6.12的窗口的窗口急性毒性试验方法Sas程序DataLD50;Inputdsn@@;Cards;2.070102.692103.503104.555105.928107.691010;Procprobitlog10;Models/n=d/lackfitintervals;Run;一.SAS软件数据步程序步急性毒性试验方法急性毒性试验方法急性毒性试验方法急性毒性试验方法SPSSv10.0SPSSv10.0的窗口的窗口急性毒性试验方法图1spss分析步骤为：⑴录入数据：如图1。急性毒性试验方法⑵选择方法：选择Analyze菜单下的Regression项中的Probit命令(如图2)，打开ProbitAnalyze对话框(如图3)。图2急性毒性试验方法图3急性毒性试验方法图4⑶选择变量：如图4。反应频数观察例数因素变量协变量协变量的转换方式下拉菜单反应模式急性毒性试验方法系统在Model栏中提供两种模型:Probit：为概率单位模型（系统默认值）;Logit：为比数比自然对数模型。本例选择概率单位模型。点击Options钮，系统弹出对ProbitAnalysis:Options对话框，如图2，系统提供三组选择项来确定各模型参数：⑴Statistics:统计量多选项。Frequencies:频数（系统默认值）。输出每个观测值的实际频数和理论频数；Relativemedianpotency:相对中位数潜力;Parallelismtest:平行检验;Fiducialconfidenceintervals:置信可信性区间，（系统默认值）;⑵NaturalResponseRate:用来显示在没有刺激条件下是否会有一个自然的反应率；None:不计算自然反应率;Calculatefromdata:依据现有样本估计其自然反应率;Value:自然反应频率，即如用户已知自然反应率时，键入其值；⑶Criteria:估计的准则。Maximumiterations:最大迭代步数（系统默认值:20）;Steplimit:参数向量中最大的容许变化量(系统默认值:0.1);Optimalitytolerance:最优容许度（系统默认值:1）。本例在NaturalResponseRate栏中选Calculatefromdata；其它选项采用系统默认方式，点击Continue钮返回主对话框。点击OK钮提交系统运行。以下为系统运行结果。急性毒性试验方法⑶输出结果：急性毒性试验方法图表明，各项参数在14次迭代运算后，回归方程为：Probit＝-3.96603+6.37315X对该方程的拟合优度Chi-square检验结果显示P值＝0.739说明拟合度良好。急性毒性试验方法系统输出了实际观察例数(NumberofSubjects)、试验动物反应数(ObservedResponse)、预期反应数(ExpectedResponse)、残差(Residual)和效应的概率(Probit)。残差急性毒性试验方法急性毒性试验方法图9-8图9-9最后，系统输出了以剂量对数值为自变量，以概率单位为应变量的回归直线散点图。本例散点图呈直线趋势，说明资料符合使用Probit法的前提条件，由对数剂量值与概率单位之间的回归直线拟合程度是较为满意。急性毒性试验方法（4）结论：九灵胃康在小鼠的经口急性毒性试验结果：LD50为4.19g/kg，95%可信范围为3.59～4.94g/kg。结果与SAS计算结果一样。寇氏法计算结果：小鼠的经口LD50为4.29g/kg，95%可信范围为3.74~4.93g/kg。