茜素红染色预实验

茜素红染色成骨分化是干细胞的一个重要特性。在特定的诱导培养基作用一段时间后，干细胞可分化为成骨细胞，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节。应用茜素红的复合物，可用于鉴定干细胞是否已成功向成骨细胞转化一．实验目的：通过茜素红染色检测细胞成骨分化二．实验原理：1.成骨诱导的过程是使钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来，即“钙结节”，鉴定钙结节的染色方法常用茜素红染色法。2.茜素红：茜素磺酸钠，茜素S，茜素红S，茜素胭脂红，1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠，1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠盐。橙黄色或黄棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。1%水溶液pH为2.15，其水溶液呈前黄褐色，加盐酸后变为黄色，加氢氧化钠后则变成蓝紫色。有刺激性。能与许多金属离子生成有色化合物，能与锆、钍、铝、钛及钙发生显色反应。3.染色原理：茜素红与钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色。三．实验试剂及仪器1.试剂：PBS10%甲醛缓冲液0.1%茜素红-Tris-HCL染液蒸馏水2.仪器：倒置显微镜四．实验步骤1.弃培养液，PBS冲洗2次2.10%甲醛缓冲液固定10min3.蒸馏水冲洗3次4.加入0.1%茜素红-Tris-HCL染液（pH8.3）,37℃下染色30min5.蒸馏水冲洗6.在倒置显微镜下观察有无茜素红染色阳性细胞五．实验结果及讨论RT-PCR检测PPARγmRNA表达水平实验目的：定量检测干细胞中PPARγmRNA的表达水平实验原理：1.由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。2.RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。检测基因表达的方法，参见NorthernBlot法。3.RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。药品及耗材：凝胶电泳检测设备PCR仪实验方法：1.采用TRIzol提取总RNA，并用凝胶电泳检测RNA含量。2.取1μg总RNA，用随机引物和反转录试剂盒合成cDNA。3.94℃，变性40s4.48℃退火30s5.72℃延伸40s6.扩增目的基因共循环反应35次，末次结束循环7.72℃再延长反应10min8.扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳9.使用Gelpro凝胶成像突向分析系统进行半定量分析10.用PPARγ的吸光度与GAPDH的吸光度比值表示PPARγmRNA的相对含量