铜绿假单胞菌中pmpR基因对_型分泌系统的调节_梁海华 (1)

2012年第57卷第6期：424~430英文版见:LiangHH,KongWN,ShenT,etal.TheeffectofpmpRonthetypeIIIsecretionsysteminPseudomonasaeruginosa.ChinSciBull,2012,57,doi:10.1007/s11434-011-4941-x《中国科学》杂志社SCIENCECHINAPRESS论文铜绿假单胞菌中pmpR基因对Ⅲ型分泌系统的调节梁海华,孔伟娜,沈托,段佳丽,段康民*西部资源及现代生物技术教育部重点实验室,西北大学生命科学学院,西安710069*联系人,E-mail:[e-mail]2011-06-21收稿,2011-11-15接受国家自然科学基金(30870097,31000049)和西北大学优秀博士论文基金(2010JQ3008)资助摘要铜绿假单胞菌中的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretionsystem,T3SS)与其致病性密切相关.已有研究表明,Ⅲ型分泌系统受群体感应系统Rhl系统的负调节,而喹诺酮系统(PQS)又正调节Rhl系统.前期的研究中我们获得了1个对PQS系统起负调控的调节子PmpR.综合它们之间的相互关系,本研究探讨了pmpR基因与Ⅲ型分泌系统的关系.结果表明,T3SS中的相关基因exoS,exoT,exoY和exsD在pmpR基因突变体中的表达明显增强.EMSA实验结果表明,PmpR蛋白并不能与Ⅲ型分泌系统基因启动子相结合,说明PmpR对T3SS可能起间接调节.此外,PQS系统对Ⅲ型分泌系统也起负调节.由上述结果可知,pmpR基因不可能通过PQS系统来调节T3SS系统,其调节途径中可能还存在着一些未知蛋白介导这种关系.关键词铜绿假单胞菌pmpR基因PQS系统Ⅲ型分泌系统基因敲除铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一种机会致病菌,它可以在人群中引起严重的急性和慢性感染,是囊肿性纤维化(cysticfibrosis,CF)病人的主要致病菌[1].铜绿假单胞菌的感染由多种致病机理引起,其中群体感应系统(quorumsensing,QS)和Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretionsystem,T3SS)与其致病性密切相关[2,3].群体感应系统是一个依赖细胞数量的基因调控系统[4,5].当细菌浓度达到某一密度时,它们的信息分子浓度就超过一个阈值水平,此时的细菌会通过信息分子发信号,改变和协调它们之间的某些行为,从而表现出单个细胞无法从事的某些生理功能和调节作用[4].铜绿假单胞菌中至少存在3个QS系统,即受高丝氨酸内酯(acyl-homoserinelactone,HSL)调节的Las,Rhl系统以及喹诺酮类(AHQ)系统[4,6,7].Las,Rhl系统分别由转录激活因子lasR,rhlR和信号合成酶lasI,rhlI组成.Las,Rhl系统信号分子分别是N-(3-oxododecanoyl)-HSL(3-oxo-C12-HSL)和N-butyryl-HSL(C4-HSL).铜绿假单胞菌中的第3个系统是喹诺酮类(2-alkyl-4(1H)-quinolone,AHQ),它包含许多信号分子,HHQ(2-庚基-4-喹诺酮)和PQS(Pseudomo-nasquinolonesignal,PQS;2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮)就是其中2种[8].DNAMicroarray研究表明,群体感应系统至少控制着铜绿假单胞菌中300多个基因的表达[9,10].同时,喹诺酮类(AHQ)系统也控制着铜绿假单胞菌中的许多致病因子的表达及生理状态[11,12].此外,铜绿假单胞菌中的喹诺酮(AHQ)系统中的PQS和Las,Rhl系统也存在着一个级联的调节关系.其中pqsH基因和转录调节子MvfR/PqsR是PQS信号分子合成必需的.PQS系统正调节rhlI,lasI的表达,而PQS的合成又受LasI的正调节,RhlI的负调节[5,11,13].革兰氏阴性菌中主要有5类蛋白分泌系统,其中T3SS与细菌的致病性密切相关.在铜绿假单胞菌中,细菌通过T3SS能够把效应蛋白从胞质输送到细胞表面并注入宿主细胞,这些效应蛋白类似于真核细胞因子,从而调控宿主细胞基因表达,抑制宿主的免疫反应及清除细菌的能力[3].目前研究较多的毒素蛋白主要有4种:胞外酶S(ExoS)、胞外酶T(ExoT)、胞外酶U(ExoU)、胞外酶Y(ExoY)[14],这些毒素蛋白介导的宿主组织损伤通过蔓延可以导致全身性的感425论文染以及败血症的发生.临床对照研究表明,患者感染表达T3SS的铜绿假单胞菌较之对照组有更高的病死率及败血症的发生率[3].T3SS的表达与环境条件密切相关,其中低Ca2+浓度以及与宿主细胞的接触是其相关基因表达的2个诱导条件[14,15].在铜绿假单胞菌中,T3SS相关基因的表达通过系统内的一种转录激活蛋白ExsA直接来调控,T3SS通过3个相互作用的蛋白(ExsC,ExsE和ExsD)感应胞外Ca2+浓度并调控ExsA的转录活性,进而调控整个T3SS相关基因的表达[16].在低Ca2+浓度条件下,ExsE通过T3SS分泌机器释放到细胞外,胞内ExsE蛋白减少,从而使ExsC蛋白与ExsD结合,从而释放了ExsA,处于自由状态的ExsA则可以激活T3SS基因的转录[17,18].在前期的研究中,我们发现了一个对PQS系统中的pqsR基因起直接调节作用的蛋白PmpR(PA0964)[19].以前的研究表明,群体感应系统Rhl系统对Ⅲ型分泌系统起负调节.此外,PQS系统对Rhl系统起正调节而Rhl系统对PQS起负调节[11].鉴于它们之间的相互调节关系,本研究探讨了pmpR基因和Ⅲ型分泌系统之间的关系.结果表明,pmpR基因对Ⅲ型分泌系统起负调节.通过EMSA实验进一步证明,它们之间是一种间接调节关系.同时,PQS系统抑制Ⅲ型分泌系统的表达.由上述研究结果可知,pmpR基因不可能通过PQS系统来调节Ⅲ型分泌系统,其调节途径中还存在一些未知蛋白介导这种调节关系.1材料和方法(ⅰ)菌株及培养条件.本研究所用菌株和质粒见表1.铜绿假单胞菌及大肠杆菌在LB液体或固体培养基37℃好氧条件下培养.在适当条件下,所用抗生素浓度如下:对于大肠杆菌,在LB培养基中的浓度为15μg/mL庆大霉素(gentamicin,Gm)、10μg/mL四环素(tetracycline,Tet)、50μg/mL卡那霉素(kanamycin,Kan)、100μg/mL氨苄青霉素(ampcillin,Amp);对于假单胞菌,在LB和假单胞分离琼脂(PIA)中庆大霉素的浓度分别是50和150μg/mL,四环素的浓度分别是75和200μg/mL;在PIA中,羧苄青霉素(carbenicillin,Cb)浓度为500μg/mL.在所有培养基中,甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim,Tmp)的浓度为300μg/mL.表1本研究中所用到的菌株和质粒菌株和质粒相关表型及特征来源菌株P.aeruginosaPAO1野生型P.aeruginosa本实验室∆pmpRpmpR置换突变体,PAO1,pmpR::Gmr[1]∆pqsRpqsR置换突变体,PAO1,Gmr本研究E.coliDH5αF-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZΔM15ΔlacX74deoRrecA1endA1araD139Δ(araleu)7697galUgalKλ-rpsLnupGInvitrogenSM10活动菌株,染色体整合了RP4;Knr[2]质粒pEX18AporiT+sacB+基因置换载体,多克隆位点来自pUC18,Apr[3]pZ1918GmGmr盒来源质粒[4]pRK2013泛宿主性辅助质粒;Tra+,Knr[5]CTX6.1整合质粒;Tetr本实验室HTb-pmpR蛋白表达载体,HTb质粒内含pmpR[1]pMS402含luxCDABE表达报道子质粒;KnrTmpr[6]pKD-exsD含exsD启动子区的pMS402;Knr本研究pKD-exoS含exsS启动子区的pMS402;Knr[6]pKD-exoY含exsY启动子区的pMS402;Knr[6]pKD-exoT含exsT启动子区的pMS402;Knr[6]CTX-exsD整合质粒,CTX6.1中含pKD-exsD片段;knr,Tmpr,Tcr本研究CTX-exoS整合质粒,CTX6.1中含pKD-exoS片段;knr,Tmpr,Tcr本研究CTX-exoY整合质粒,CTX6.1中含pKD-exoY片段;knr,Tmpr,Tcr本研究CTX-exoT整合质粒,CTX6.1中含pKD-exoT片段;knr,Tmpr,Tcr本研究2012年2月第57卷第6期426(ⅱ)启动子-报道子融合体的构建.质粒pMS402是带有无启动子luxCDABE报道子的载体,本研究用该质粒构建启动子-报道子luxCDABE融合体.首先以PAO1基因组为模板,用引物S1与S2进行PCR扩增exsD基因的启动子序列,反应条件:95℃,4min,95℃,50s,57℃,50s,72℃,90s,30个循环;72℃,10min.得到的产物经纯化后用XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切,与同样酶切后的pMS402质粒进行连接,得到质粒pKD-exsD.然后用PacⅠ酶切该质粒,得到大小2个片段,将大片段切胶回收纯化.同时用PacⅠ酶切质粒CTX6.1,该质粒可利用噬菌体结合位点进行专一性重组.将上述大片段与CTX6.1进行连接,用酶切方法验证上述重组体,得到质粒CTX-exsD.通过三亲株杂交的方法将该启动子-报道子luxCDABE融合体整合到PAO1及相应突变体的染色体组上.用同样的方法将CTX-exoS,CTX-exoY,CTX-exoT分别整合到上述菌株中.(ⅲ)pqsR突变体的构建.本实验通过基因敲除的方法获得目的基因突变体.根据铜绿假单胞菌PAO1的pqsR基因序列设计引物,因pqsR基因序列中间没有合适的酶切位点插入lacZ序列,故需要设计2对引物.2对引物分别为:L1和H1及L2和H2.以PAO1基因组为模板,用上述2对引物分别进行PCR扩增,反应条件:95℃,4min,95℃,50s,57℃,50s,72℃,90s,30个循环;72℃,10min.得到的产物经纯化后双酶切,将2个pqsR基因片段按顺序与有sacB致死基因的穿梭质粒pEX18Ap进行连接,得到质粒pEX18Ap-pqsR,用SmaⅠ酶切该质粒.同时用SmaⅠ从质粒pZ1918Gm单酶切,得到一段大小约4kb含Gm抗性基因和lacZ基因的片段,将SmaⅠ酶切的pEX18Ap-pqsR与该片段进行连接,得到质粒pEX18Ap-pqsRGm.突变体用三亲株杂交的方法进行同源重组获得.供体菌是含有质粒pEX18Ap-pqsRGm的大肠杆菌DH10B,受体菌分别为PAO1和PAOD100,介导菌是E.coli(pRK2013).供体菌和介导菌37℃,200r/min过夜培养,受体菌42℃,200r/min过夜培养.离心收获细胞重悬于PBS缓冲液.3种菌液按比例(2:2:1)混匀后点在LB平板上过夜培养,所得菌体按合适倍数稀释后,涂在含有150μg/mLGm的PIA平板上37℃培养.所得单克隆在含有10%蔗糖的PIA平板上划线,挑取几个单克隆裂解作为模板,以L1和H2及与lacZf作为引物,通过PCR扩增验证突变株∆pqsR.(ⅳ)基因表达水平的测定.将含有启动子-报道子融合体的菌株在LB固体培养基上划线,37℃过夜培养.挑取上述菌株的单克隆接种到含100μLLB培养基的白色96孔板中,37℃,200r/min培养12h.然后按7%接种量转接到新鲜LB培养基中,继续培养3h.取转接后菌液用培养基做1:20稀释,取100μL加入黑色底部透明96孔板中,同时用50μL矿物油覆盖.在多功能酶标仪