病毒基因工程

Virusgeneticengineering病毒基因工程疫苗病毒基因工程疫苗：基因缺失减毒活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、转基因植物可食疫苗、合成肽疫苗和抗独特性疫苗基因工程疫苗的优点生产成本降低可以生产目前尚无敏感细胞的病毒疫苗如：乙型肝炎病毒表面抗原疫苗采用重组病毒系统如痘病毒（易于制备同一载体的多价病毒疫苗）可以完全去除病毒基因中具有潜在危害性的部分（某些病毒的致癌基因）可以制备单一成分病毒疫苗，也可制备同一病毒多成分的病毒疫苗抗病毒药物和制剂很多抗病毒感染的药物是一种生物药物（干扰素、转移因子、活性多肽等），生物药物有的来源于病毒，有的来源于病毒感染细胞时宿主的反应产物，它们都是有相应的细胞中产生的，在组织细胞内含量极微，而基因工程可以大量生产多肽和蛋白质病毒载体病毒载体优点（1）病毒基因组结构简单，遗传背景比较清楚，易于改造和操作，适合于大规模的商业应用（2）病毒增殖速度快外源基因在很短时间就可大量积累（3）病毒自身具有感染特定受体细胞的能力，外源基因的导入效率较高（4）病毒具有特异的宿主范围和组织嗜性，外源基因的导入具有一定的靶向性，对基因的治疗有益（5）病毒种类繁多，且各具不同的特性，构建的病毒载体也具有不同的特点，可以用于不同类宿主的基因转移与表达，以满足不同的需要，扩大基因工程的适用范围病毒载体的应用高水平表达特定基因产物真核细胞基因的分子生物学研究病毒载体可被用作基因递送系统病毒载体的主要类型一噬菌体载体二杆状病毒载体三动物病毒载体四植物病毒载体入噬菌体基因组结构：可分为左臂、中段和右臂三个部分。左臂从A到J,长约20kb，其中的基因编码构建头部、尾部、尾丝等组装完整噬菌体所需的蛋白质。中段长约20kb，是入噬菌体DNA整合和切出、溶原性生长所需的序列。右臂长8~10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的基因调控序列以及入噬菌体DNA的复制起始区。入噬菌体载体构建利用入噬菌作载体，主要是将外源DNA替代或插入中段序列，使其随左臂和右臂一起包装成噬菌体，再去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。M13噬菌体基因组结构核心部分是一单链环状DNA分子，长6407个核苷酸，有10个基因组成，90%以上基因组序列编码蛋白质，除了在基因Ⅱ于基因Ⅳ以及基因Ⅲ与基因Ⅷ之间有较长的基因间隔区（IR）外，其它基因之间的间隔仅有几个核苷酸。M13噬菌体载体构建利用M13基因组中一段507个核苷酸的基因间隔序列（IS），该区可接受外源DNA的插入而不影响M13噬菌体的活力，通过常构建M13载体都是在RF-DNA的IS区插入选择标记基因，然后在选择标记基因区内组装合适的多克隆位点，以便于外源片段的插入。M13丝状噬菌体载体的特点M13的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主细胞生长缓慢M13DNA在宿主细胞中既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13DNA导入宿主细胞中M13的包装不受DNA大小的限制，噬菌体颗粒大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装可用于制备大量纯化的单链DNA分子二杆状病毒表达载体A基本原理目的基因插入转移载体。目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯化获得重组病毒。重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。杆状病毒表达载体的构建转移载体通常由三部分组成：E.coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保证转移载体能在大肠杆菌中扩增。含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下插入要表达的外源基因。启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA序列，用于与野生病毒DNA同源重组。杆状病毒表达系统的优缺点优点对外源基因容量大适合表达细胞毒性蛋白安全性表达产量高后加工过程完全可以同时表达多个外源基因体内表达缺点瞬时表达糖基化简单动物病毒载体分类整合型载体病毒载体整合入宿主细胞染色体，并随染色体的复制而复制，可持续表达外源基因，但存在插入诱变的危险，主要包括SV40载体和反转录病毒载体。游离型载体病毒载体不整合入宿主细胞染色体，以病毒颗粒的形式独立复制，或在辅助病毒的协助下复制，没有插入诱变的危险，一般为瞬时表达，主要包括腺病毒和痘病毒。植物病毒郁金香碎色花病毒造成植物病毒载体类型置换型载体插入型载体互补型载体抗原展示型载体融合/释放型载体植物病毒载体表达优点*部分植物病毒对寄主的感染时系统性的，它能够将基因组扩散到被感染植株的所有细胞。*植物病毒载体有可能解决将外源基因导入像玉米这样的单子叶植物问题。*被感染的植株能够繁殖出大量的病毒颗粒，因此有可能通过重组病毒载体利用植物来生产大量的外源蛋白质。缺点稳定性：较差，常由于病毒基因的重组而导致丢失外源基因外源基因大小限制：表达外源基因的大小受被置换基因大小的限制，而插入载体表达中的外源基因过大，则可能导致表达困难或不能系统侵染病毒载体的接种方法：比较昂贵和繁琐安全性