基因工程实验_biochemlab

基因工程实验生物化学资料网及其体外连接实验五感受态细胞的制备实验六重组质粒的转化实验七质粒的提取实验八重组质粒的酶切鉴定实验一实验计划表一、实验目的１、了解本学期整体的实验流程及安排。２、熟练使用微量移液器。３、学习制备琼脂糖凝胶。•生物化学资料网基因工程（GeneEngineering）又称ＤＮＡ重组技术，把不同生物的ＤＮＡ与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。二、实验原理•生物化学资料网凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子、手套琼脂糖、1×TBE、加样缓冲液三、实验用具及试剂⑴目的基因的获取基因组总ＤＮＡ提取凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增目的基因ＰＣＲ产物的电泳检测ＰＣＲ产物纯化获得目的基因ＭＨＣ四、实验操作1.本学期实验计划•生物化学资料网⑵ＤＮＡ重组、转化ＭＨＣ与pMD18-T连接DH5a感受态细胞制备转化、平板涂布、培养⑶筛选与鉴定抗生素抗性筛选挑单菌落培养提取质粒质粒酶切、电泳检测2.微量移液器的使用•将微量移液器按钮轻轻压在第一挡•垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部•缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。•等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过•平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、•提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过•然后按吸头弹射器除去吸头⑴使用操作•生物化学资料网⑵使用注意事项•未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。•一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。•不要横放带有残留液体吸头的移液器•不要用大量程的移液器移取小体积样品•微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧恢复原形，保持弹性。•为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行校准。•生物化学资料网琼脂糖凝胶制作•选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中，梳子插上。•量取25ml1×TBE溶液放入锥形瓶或烧杯中•称量0.25g琼脂糖，倒入锥形瓶中•将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾2-3次，琼脂糖彻底融化•锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中•等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。一、实验目的实验二基因组总ＤＮＡ提取生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。二、实验原理消化缓冲液:TE、EDTA、NaCl、SDS、蛋白酶KTris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇，70%乙醇三、实验用具与试剂微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱１、切取组织，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。以消化缓冲液处理55℃水浴过夜，获得组织消化液。２、取出消化组织液，5000rpm，３min，取上清液于新离心管。３、加等体积Ｔris-平衡酚，轻轻混匀５min。4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新离心管。５、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混匀５min。６、同４。７、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀５min。８、同４。四、实验步骤９、加1/10体积3mol/LNaAc，及２.５倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。－２０℃沉淀３０min。１０、12000rpm，15min，弃上清。１１、加70%乙醇1ml，混匀。１２、同１０。１３、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。１４、加３０ulTE或ddH2O溶解ＤＮＡ。１５、琼脂糖凝胶电泳检测。提取染色体ＤＮＡ的基本原理是什么？操作中应该注意什么？五、思考题１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。３、了解ＰＣＲ扩增的参数设计。一、实验目的实验三ＰＣＲ扩增１、聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。２、ＰＣＲ反应体系引物、dNTP、Mg２＋、模板、TaqDNA聚合酶，Buffer。二、实验原理３、ＰＣＲ循环参数①9５℃5min②9５℃30s③5２℃30s④72℃30s⑤goto②２９times⑥72℃10minTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液三、实验用具与试剂旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统１、在0.2mlPCR微量离心管中配制30ul反应体系。ddwater20.5ul10×PCRbuffer（不含MgCl2）3ul25mMMgCl22ul10mmol/LdNTP1ul10μmol/LPrimer11ul10μmol/Lprimer21ul模板1ulTaq酶0.5ul总体积30ul四、实验步骤２、在离心机中混匀。３、ＥＰ管放入ＰＣＲ仪中，按照原理中的条件设置程序，进行ＰＣＲ反应。４、PCR结束后，取3ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。五、思考题PCR中产生非特异性条带的原因可能有哪些？实验四凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接一、实验目的1.学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。2.掌握DNA体外连接的方法。二、实验原理1.DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关•DNA分子大小•DNA分子构象•琼脂糖凝胶浓度•电泳所用电压•电泳缓冲液•，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。3.Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3’端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。•生物化学资料网三、实验用具及试剂凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯1.5mlEP管，1.5mlEP管架，65℃水浴锅PCR产物，1×TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000marker•琼脂糖凝胶电泳2.在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量3.加入5个凝胶体积量的DR-ⅠBuffer4.混匀65℃加热融化凝胶块5.加入DR-ⅠBuffer量的1/2体积的DR-ⅡBuffer,当目的片段小于400bp再加入终浓度为20%的异丙醇6.将上述溶液short后转移至spincoloumn中12000rpm,1min弃滤液7.加入500ulRinseA12000rpm30s弃滤液8.加入700ulRinseB12000rpm30s弃滤液9.同8四、实验步骤10.将spincoloumn安置于新的1.5mlEP管中在spincoloumn膜中央加25ulElutionBuffer放入烘箱1min12000rpm1min保存1.5mlEP管1%胶检测11.链接反应（冰上操作）在一支0.2mlEP管中加入以下试剂：纯化的目的DNA片段4.5ulVector0.5ul连接液5ul混匀16℃连接过夜五、思考题为什么连接反应的温度要定在16度？•学习和理解影响细胞感受态的因素一、实验目的•生物化学资料网感受态是指受体（或者宿主）细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是有受体菌的遗传性所决定的。转化过程中所用的受体细胞一般是限制—修饰系统缺陷的变异株，既不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。用Cacl2处理受体细胞，使细胞的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。二、实验原理•生物化学资料网三、实验用具及试剂•培养皿，离心管，冷冻高速离心机，超低温冰箱，摇床，锥形瓶•Cacl2，LBAmp-液体培养基，LBAmp-固体培养基，DH5α甘油菌1.先从保存菌种DH52(-70℃),划线培16h(37℃)2.从平板中挑取一个单菌落移到4ml，LBAmp-培养基中，37℃摇荡过夜180~250rpm3.按1%的接种量将过夜培养的菌转接于50mlLBAmp-的培养基中，37℃，250rpm（2h~2.5h）4.当培养菌生长至OD600达0.5~0.6时（约2~2.5h），将培养菌取出，在无菌条件下将细菌转移至50ml无菌聚乙烯离心管中，冰浴10min，以使培养液冷至0℃四、实验步骤5.4℃，5000rpm/min,7min6.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬于4℃，5000rpm/min，5min7.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬冰上放置30min，于4℃，5000rpm/min，5min8.用2ml冰冷Cacl2溶液重悬各管细胞，然后按每管100ul的量分装于预冷的0.5mlEP管中存于-70℃•生物化学资料网五、思考题•如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？•生物化学资料网实验六重组质粒的转化一、实验目的掌握重组质粒的转化方法•生物化学资料网二、实验原理1.转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。2.化学转化法利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。•生物化学资料网三、实验用具及试剂•水浴锅，培养箱，枪头，冰盒，超净台，微量加样器，制冰机，牙签•DH5α感受态细胞，连接产物，LBAmp-液体培养基，LBAmp+液体培养基，LBAmp+培养基平板1.5ul连接液加100ul感受态细胞（-70℃取出），置冰上，加后轻轻旋动2.冰上静置30min3.42℃水浴90s热休克，冰上3min4.加10ulLB（Amp-）至菌液，混匀（颠倒）5.37℃烘箱30min6.37℃，摇床30min180rpm7.涂平板100ul/板，37℃培养12~16h8.挑克隆挑取菌落接入5mlLBAmp+液体培养基中，37℃振荡过夜四、实验步骤•生物化学资料网五、思考题•当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有Amp的LB培养基平板前，为什么要在LB培养基中培养1h?•掌握质粒最常用提取方法一、实验目的•生物化学资料网二、实验原理•细菌质粒DNA的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量较小、易于复性的特点进行的