第三章 基因工程常用技术-9.18

第三章基因工程常用技术一、质粒DNA的提取二、核酸凝胶电泳技术三、核酸分子杂交技术四、聚合酶链反应(PCR)技术五、DNA序列分析技术质粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技术，最常用的是碱裂解法。一、质粒DNA的提取在强碱性溶液中，DNA双链的氢键断裂变性；当溶液恢复中性时，DNA双链复性。（一）碱裂解法提取质粒DNA1、原理4在变性后双链不分离、复性快。共价闭合环状的质粒DNA：5强碱性变性后双链分离、难以复性而形成缠绕结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，离心时沉淀。线性染色体DNA：2、碱裂解法质粒DNA提取的步骤1）溶菌使用“溶液I”溶解细菌细胞壁。溶液I：50mM葡萄糖25mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA4-5mg/ml溶菌酶7葡萄糖：增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。EDTA：Mg2+、Ca2+螯合剂，抑制DNase活性，防止DNA被降解。8溶菌酶：为糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分--肽聚糖中的-1,4糖苷键，具有溶菌作用。2）变性加入“溶液II”，使细菌细胞膜破坏、使蛋白质和DNA变性。溶液II：0.2NNaOH（10N贮存液现用现稀释）1%SDS10NaOH：是强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。是离子型表面活性剂，溶解细胞膜和细胞内蛋白，并结合成“蛋白质-SDS”复合物，使蛋白质（包括DNase）变性沉淀。SDS：113）中和加入“溶液III”使DNA复性、蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。溶液III：5NKAc60ml冰HAc11.5ml水8.5ml12KAc：用冰HAc把KAc溶液的pH调到4.8，以中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、蛋白质-SDS复合物沉淀。冰HAc：13上清液中含有质粒DNA。4）离心去除沉淀5）纯化DNA酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提或柱层析。15酚：比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚。蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。防止抽提时振荡起泡。氯仿：异戊醇：162倍体积的无水乙醇沉淀DNA。6）沉淀DNADNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。1770%乙醇洗涤DNA，干燥。7）洗涤8）贮存用含RNaseA(20g/ml)的TE溶解DNA，贮存于-20℃。18TE：由Tris-HCl缓冲液和EDTA配制。EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸或硼酸缓冲液），利于后续操作。RNaseA：降解残留的RNA。许多公司研制出商品化质粒提取试剂盒，原理大多依照碱裂解法，但在纯化步骤上采用柱层析。203、影响质粒DNA产量的因素质粒的产量受提取过程中各因素的影响，但最重要的是菌株的遗传背景和质粒自身的拷贝数。一般使用endA基因突变的E.coli菌株，如DH5、JM109等。1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶I，在Mg2+存在下，可将双链DNA消化为7bp的寡核苷酸片断。22是直接决定DNA产量的重要因素之一。2）质粒拷贝数3）质粒大小分子量大的质粒拷贝数低。常用质粒的理论产量pUCpGEMpBR322ColE1pSC1012.7kb2.7kb4.4kb4.5kb9.0kb500-700300-7002515≈62.9-4.11.8-4.10.320.15≈0.12质粒分子大小拷贝数质粒产量（kb）（g/ml）（二）DNA的定量和纯度测定1、紫外光谱法原理：基于DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰（蛋白质在280nm处有吸收峰），用微量比色杯在紫外分光光度计直接测定。在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml。26纯DNA样品：OD260/OD280=1.8OD260/OD2302.0OD260/OD2302.0：有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。OD260/OD2801.6：有蛋白质污染；OD260/OD2801.9：有RNA污染；27原理：利用溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中，在紫外光照射下能发红色荧光，将其荧光强度与已知浓度的DNA(如DNAmarker)电泳条带对比，可估算出DNA含量。2、琼脂糖凝胶电泳估计（三）DNA分子量的估计通过琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNAmarker对比得知。二、核酸凝胶电泳技术（一）电泳的基本原理生物大分子在一定pH条件下，通常带电荷，将其置于电场中，会以一定的速度向与其电荷性质相反的电极迁移，迁移速度称电泳速率。30摩擦系数与分子的大小、构型及介质的粘度有关。电泳速率与电场强度、分子所带的净电荷数成正比，与分子与介质的摩擦系数成反比。在生理条件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态，故DNA实际上呈多聚阴离子状态，在电场中向方向迁移。糖-磷酸骨架在结构上重复，故等量的双链DNA几乎带等量的净电荷。正极32如电场强度一定、电泳介质相同，电泳速率就取决于核酸分子的大小和构型。构型相似的分子：分子量越大、迁移越慢。分子量相同的分子(如质粒)：cccDNA迁移最快、L-DNA次之、ocDNA最慢。33固体支持介质：琼脂糖(agarose)聚丙烯酰胺(polyarylamide)固体支持介质可形成复杂的网孔结构，DNA穿过这些网孔才能到达正极。分子量小、结构致密的DNA分子更易穿过网孔，泳动速度也越快。（二）琼脂糖凝胶电泳是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖：37琼脂糖凝胶：琼脂糖在电泳液中加热到沸点后溶解，冷却后凝固成均匀的胶体“胨”，成为很好的电泳介质。38琼脂糖浓度(%)分离DNA的范围(kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3琼脂糖浓度的高低决定凝胶孔隙的大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺：由丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚合而成。40在过硫酸铵和TEMED存在时，丙烯酰胺单体形成长链，由N,N’-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由基团反应而发生交联，形成聚丙烯酰胺。为中枢神经毒物，尽量避免接触和吸入!过硫酸铵：催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合。丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺：碱性条件下产生自由基。TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二铵)：42聚丙烯酰胺浓度(%)分离DNA的范围(bp)3.51000-20005.085-5008.060-40012.040-20015.025-15020.06-100聚丙烯酰胺浓度的高低决定凝胶孔隙的大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。43聚丙烯酰胺凝胶的优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高得多。0.3-2%琼脂糖凝胶电泳分辨率：60,000-100bp；3.5-20%聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率：2,000-6bp。44（四）电泳缓冲液Tris-乙酸（TAE）Tris-硼酸（TBE）Tris-磷酸（TPE）TAE价格便宜，但缓冲容量低；TBE与TPE缓冲容量高，分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，易使DNA沉淀。推荐使用45EDTA可螯合二价阳离子，抑制DNase活性，防止DNA被降解。临用时用水稀至0.5TBE（20倍稀释）10TBE缓冲液的配制：Tris碱108g硼酸Boricacid55gEDTA9.3g加H2O至1L（调PH为8.0-8.2）46（五）核酸电泳的指示剂与染色剂1、指示剂：常用溴酚兰，在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，迁移率分别与1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。47使样品呈色，便于加样操作；指示剂与蔗糖、甘油组成加样缓冲液。增加样品比重，确保DNA均匀沉入加样孔；在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测DNA电泳的速度和位置。加样缓冲液的作用：48492、染色剂：核酸电泳后，需经染色才能显出带型。溴化乙锭染色法银染色法50溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)能插入到DNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出红色荧光。1）溴化乙锭染色法：51可将EB直接加到凝胶介质中（终浓度0.5g/ml）；也可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10-15min。EB与DNA分子结合，而不与凝胶结合，DNA分子吸收EB并发出荧光。52琼脂糖凝胶EB染色后，在紫外光下观察，可检测出≥50ng的DNA。在适当染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。532、银染色法：Ag+可与核酸形成稳定的复合物，用还原剂(如甲醛)使Ag+还原成银颗粒，可将电泳条带染成黑褐色，用于聚丙烯酰胺凝胶染色。优点：灵敏度比EB高200倍。缺点：银染色后，DNA不宜回收。聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染结果银染10min银染15min三、核酸分子杂交技术1968年，华盛顿卡内基学院的RoyBritten及其同事发明。目的：用特异探针鉴定复杂靶DNA中的同源片段。DNA与DNA杂交：A=T、G≡CDNA与RNA杂交：A=U、G≡C依据：碱基互补、变性和复性随温度逐渐降低，变性的两条单链重新形成互补双链。在高温下，核酸双链解为两条单链；碱基互补变性：复性：利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针(probe)，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补同源核酸序列的存在。（一）核酸探针指一段带有检测标记、与目的DNA片段特异互补、已知序列的核酸片段。探针长度一般以50-300bp为宜。核酸探针的种类：放射性探针非放射性探针根据核酸性质不同，分为：RNA探针寡核苷酸探针DNA探针cDNA探针根据标记方法不同，分为：寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)简并探针组成的寡核苷酸探针库6个氨基酸连续序列→倒推基因序列→人工合成单一已知序列的寡核苷酸探针已知序列→人工合成根据生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针；简并探针的设计依据：参考生物体EST(expressedsequencetag)数据库，进行倾向性简并序列设计。EST：对一个随机选择的cDNA克隆，进行5’端和3’端单一次测序，获得的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，平均长度360±120bp。寡核酸探针的优点：序列短，杂交速度快、特异性强；可在短时间内大量制备；可在合成中进行标记；可合成单链探针，避免双链探针在杂交中自我复性，提高杂交效率；可检测靶序列内1个碱基的变化。寡核苷酸探针的设计原则：长度18-50bp；分子内部不含互补区；GACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGCAG+C含量40-60%；避免同一碱基连续出现（不能多于4个）；与非靶序列70%以上同源性、或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。641、标记物的种类：前者更敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。非放射性：生物素、地高辛、荧光素等。放射性：32P、35S、125I等；（二）核酸探针的标记缺刻平移法随机引物延伸法反转录标记法末端标记法2、探针标记方法：1）放射性同位素标记：5’…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’1）Klenow酶介导的3’末端标记法：KlenowdNTPs（-32P-dATP）5’…G-C-T-G-A-A-T-TA-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-AT-T-A-A-G-C-T-C…5’末端标记法675’3’3’5’AA-32P-ddATPTdT5’5’2）TdT介导的3’末端标记法：3）T4-PNP介导的5’末端标记法：5’P3’HOOH3’P5’5’HO3’HOOH3’OH5’CIPT4-PNP-32P-ATP5’P3’HOOH3