第二章-3 目的基因获得-9.15

第二章基因工程的基本条件一、用于核酸操作的工具酶二、基因克隆载体三、目的基因的获得四、基因工程受体菌或细胞三、目的基因的获得限制酶酶切直接分离法PCR扩增法从mRNA合成cDNA化学合成法通过构建基因文库分离法对已克隆在载体中的目的基因，可根据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择适当的限制酶酶切，获得目的基因。（一）限制酶酶切直接分离法注意：目的基因内部不能有该限制酶的切点，否则目的基因会被切成碎片！Ampr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1pPIC9K/hVEGF165EcoRINotIBglIIhVEGF165BglII9.8KbAmpr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1pPIC9K9.3KbBglIIBglIISnaBIEcoRIAvrIINotIf1oriAmprlacZpGEM-T/hVEGF165hVEGF1653.5Kb（二）PCR法扩增目的基因利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。PCR(polymerasechainreaction)：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。双链DNA解链为单链DNA；引物与模板单链DNA的特定互补部位配对、结合；退火：变性：延伸：变性退火延伸30thcycle？由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，即Y=2n(n为循环次数)。230(109)copiesPCR技术的发明--DNA操作技术的革命发明人：美国生化学家KaryB.MullisTheNobelPrizeinChemistry1993MullisKB.Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.ScientificAmerican.1990,262(4):56-61,64-5.1990.04MullisKB.Dancingnakedinthemindfields.1998.041983.03开汽车时的联想：蜿蜒崎岖的山路--DNA双螺旋行驶的汽车--一小段DNA引物1972在加州大学伯克利分校获得博士学位1979进入私人生物技术公司Cetus1983.08正式做有关PCR原理的报告1983.09Mullis开始动手做实验1984.11首次取得可信结果1985.01RandallSaiki加入，结果毋庸置疑1985.03Cetus公司申请专利1985.12SaikiRK,ScharfSJ,FaloonaFA,MullisKB,HornGT,ErlichHA,ArnheimN.Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.1985,230(4732):1350-4.1986.05冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会1987.01MullisKB,FaloonaFA.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecatalyzedchainreaction.MethodsinEnzymology.1987,155:335-50.1991.12Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-LaRoche公司1986.06Saiki等将耐热DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技术。SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfSJ,HiguchiR,HornGT,MullisKB,ErlichHA.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science.1988,239(4839):487-91.1988.011989Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。1986.09Mullis离开Cetus公司EppendorfBio-radABIPCR法扩增目的基因的前提：已知目的基因全序列或其两侧序列，化学合成与模板互补的上、下游引物。Taq酶无3’→5’外切酶活性，无阅读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30次循环Taq酶错配率约0.25％。措施：问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。原因：选择高保真Taq酶，如Pfu。因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。5’AAPCR扩增产物5’由Taq酶扩增的PCR产物，3’末端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎总是A，T载体TT5’5’T7lacZMCSoriAmpr可用T载体克隆。（三）从mRNA合成cDNA以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，然后在Klenow酶作用下合成双链cDNA。此法适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白mRNA的比例占总mRNA的90%以上。目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%。高丰度mRNA：低丰度mRNA：步骤：dNTP逆转录酶primer逆转录酶催化合成cDNA第一链mRNAcDNA钓取目的基因的mRNAmRNA逆转录酶逆转录酶去除mRNA-cDNA杂交链中的mRNA链cDNAKlenow酶dNTPKlenow酶合成cDNA第二链cDNAcDNA钓取目的基因的mRNA：与oligo(dT)碱基互补的mRNA结合到柱上，非mRNA(tRNA、rRNA）流走。总mRNAoligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤维素柱oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤维素柱总RNA1）提取特定组织或细胞的总RNA，用oligo(dT)纤维素柱分离总mRNA。2）根据已知基因序列合成DNA探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化特定mRNA。与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特定mRNA探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA纤维素柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA纤维素柱总mRNA克隆平端双链cDNA的方法：平端直接与载体连接；平端接同聚尾；加装人工接头(adapter)；加装衔接物(linker)。加装同聚物尾：利用TdT，在双链cDNA和载体3’端加互补的同聚物尾，退火连接成重组分子。1972年，斯坦福大学P.Labban和P.Kaiser发明。CCCCCCCCCCCCdCTPTdTcDNA5’3’载体5’3’GGGGGGGGGGGGdGTPTdTCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGT4DNAligase加装人工接头(adapter)1978年，康奈尔大学吴瑞发明。adapter是人工合成的一头具有某种限制酶的粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。GTCGCAGCTTAA5’3’EcoRIadapter注意：adapter易通过粘端碱基配对形成二聚体。GTCGCAGCTTAA5’3’AATTCGACGCTG3’5’AATTCGACGCTGGTCGCAGCTTAA5’3’3’5’T4DNAligase将adapter连接到双链cDNA的两端，直接成为人工粘端。CIP去除adapter的5’-P，使5’-P成为5’-OH。5’P-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-P5’3’3’CIP5’OH-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-OH5’3’3’措施：加装衔接物(linker):linker是人工合成的一段由10-12个核苷酸组成、具有一个或多个限制酶识别序列的平末端双链寡核苷酸短片段。EcoRIlinker5’TGGAATTCCAACCTTAAGGT5’3’3’将双链cDNA与linker连接，再用限制酶酶切，可产生粘性末端。（四）化学合成法1979年，成功合成E.coli酪氨酸tRNA基因。---Science1976年，H.G.Khorana提出用化学方法合成基因的设想；已知目的基因的DNA序列。化学合成法的前提：小片段粘接法补钉延长法大片段酶促法战略：化学合成的DNA片断一般局限在200bp以内。1）小片段粘接法：分别合成12-15bp的单链DNA小片段。混合退火T4DNAligase片断之间有互补区，混合退火形成有断点的双链，再由T4DNAligase连接成完整双链。2）补钉延长法：混合退火片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。T4DNAligaseKlenow分别合成12-15bp的单链DNA小片段及20-30bp的单链DNA中片段。3）大片段酶促法：分别合成40-50bp的单链DNA大片段。混合退火T4DNAligaseKlenow片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。化学合成的份额较大，成本较高。大片段化学合成的收率极低，如合成50bp的DNA单链大片段的总收率仅7.7%。三种方法各有利弊：小片段粘接法：大片段酶促法：化学合成DNA的单链片段愈短，收率愈高；化学合成的份额较小，成本较低；化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。DNA合成仪是根据固相亚磷酰胺三酯法原理设计的。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。DNA合成仪基因合成一般都是自己设计序列，交给商业公司合成。DNA化学合成的用途：合成天然基因修饰改造基因设计新型基因合成测序或PCR引物制备寡核苷酸探针制备人工接头(adaptor)和衔接物(linker)合成天然基因：有些组织特异性mRNA含量很低，很难用cDNA法克隆。有些基因比较短，化学合成费用较低。如：生长激素释放抑制激素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。合成寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)：根据已知核酸序列，用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，作为探针使用。若未知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸序列倒推出核酸序列，但需考虑密码子的简并性。大多数氨基酸拥有简并密码子。某段连续的氨基酸序列:CysMetAspGluMetLys可能的DNA序列:TGTATGGACGAAATGAAACTGG设计系列探针:TGTATGGACGAAATGAAATGTATGGACGAGATGAAATGTATGGATGAAATGAAATGTATGGATGAGATGAAATGTATGGACGAAATGAAGTGTATGGACGAGATGAAGTGTATGGATGAAATGAAGTGTATGGATGAGATGAAGTGCATGGACGAAATGAAATGCATGGACGAGATGAAATGCATGGATGAAATGAAATGCATGGATGAGATGAAATGCATGGACGAAATGAAGTGCATGGACGAGATGAAGTGCATGGATGAAATGAAGTGCATGGATGAGATGAAG（五）通过构建基因文库分离目的基因基因库(genepool)基因文库(genelibraryorgenebank)基本概念:是特定生物体全基因组的集合（天然存在）。基因库：是从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆形式存在（人工构建）。基因文库：根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因组文库：cDNA文库：含全部基因。含全部蛋白质编码的结构基因。鸟枪法构建；材料来自染色体DNA；cDNA法构建；材料来自mRNA；1、基因组文库将某种生物基因组DNA经超声波或限制酶部分酶切处理后，与载体连接，