实时荧光定量PCR在临床医学中的应用

实时荧光定量PCR在临床医学中的应用罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断•病原体测定•肿瘤诊断•基因差异表达研究主要内容4PCR与基因诊断技术•基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病做出诊断的方法。•Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。•1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。5荧光定量PCR技术•实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光染料：SYBRGreenI、EVAGreen，ResoLight荧光探针：TaqMan、HybridizationProbes、MolecularBeacon6罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程LightCycler®Real-TimePCRPlatform超过十年的实时荧光PCR的技术革新LightCycler®1.0Instrument32320SamplenumberDetectionchannelsSamplevolume[µl]LightCycler®2.0Instrument32620/100LightCycler®1536Instrument153620.5–2µl1998200320092005/2008LightCycler®480Instruments(I,II)96/3845/610-100/5-20BreakthroughtohigherThroughputLightCycler®480广泛的应用绝对定量相对定量基于熔解曲线的基因分型终点法基因分型ATAATT基于HRM的突变扫描罗氏应用科学部在临床诊断的整体解决方案基因诊断•病原体测定•定性分析•绝对定量•耐药性研究•肿瘤诊断•基因差异表达研究主要内容10荧光定量PCR技术的临床应用•病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测•性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV）的基因检测•优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒II型（HSV）、风疹病毒•其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等12荧光定量PCR方法检测HBV感染的各期血清标本Copies/mlHBeAg阳性慢性乙型肝炎病人经α干扰素治疗后HBeAg转阴非活动性HBsAg携带者血清原先血中HBVDNA阳性，已痊愈超过12个月的血清14HBsAg和HBeAg均阳性而HBVDNA阴性？•干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。•PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。•病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBVDNA很少或缺乏。15抗病毒治疗中存在的问题——逆转录酶催化中心YMDD变异•YMDD：酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸•蛋氨酸（M）突变为异亮氨（I）或纈氨酸（V）形成YIDD变异株或YVDD变异株16HBV-YMDD变异检测的临床意义•动态检测：服用拉米夫定3个月开始，每月检测1次•提前发现：可在耐药临床表现发生前1-4个月检测出突变株•及时调整：适时调整用药方案，防止因耐药而导致病情恶化18小结•荧光定量PCR可以对致病微生物核酸含量进行定量检测•弥补免疫检测的缺陷（如HCV）•缩短诊断的窗口期（如HIV），利于早期诊断•对治疗过程进行疗效监测•指导用药过程及剂量，以制定合理的疗效方案•结合临床表现，并与传统的免疫学、影像学等诊断方法来综合评判，更为科学。罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断•病原体测定•肿瘤诊断•突变检测——个性化用药•甲基化•基因差异表达主要内容高分辨率熔解曲线定义高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:•它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR仪器与专门的分析算法•分辨率高，可以区分一个碱基突变的多组核酸样本，可以区分野生型（纯合子）、突变型（纯合子），杂合子•使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)•与其它方法相比，具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！HRM的应用•SNP位点的检测(已知与未知位点)单倍型分析，杂合性丧失的筛查,种群中优势等位基因分析，物种鉴定,DNA遗传作图，潜在易感基因的筛选医学应用：产前诊断，传染病与遗传疾病的监控，药物疗效的观察•突变，包括小片段的插入和缺失医学应用：肿瘤的快速诊断,治疗与预后评价•甲基化应用医学应用：肿瘤的快速诊断,治疗与预后评价饱和荧光染料创新的饱和荧光染料能够识别单碱基突变,并且不抑制PCR反应不饱和双链DNA荧光染料SYBRGreenI•纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同饱和双链DNA荧光染料ResoLight、LCGreen、EvaGreen•都为绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm，发射荧光波长470-520nm。•序列的变化会导致熔解曲线的显著变化纯合子杂合子VSvs创新的HRM染料准确区分野生型纯合子和杂合子LC480HRMMasterMix–ResoLightDyeSYBRGreenIvsLightCycler®480ResoLightDye后者提供更高的信号灵敏度和分辨率24HRM技术和dHPLC的分辨率比较dHPLCHRMwtmuthetwtwtwtwtwtmutmutmutmutmutwthetnoseparationofhomozygousvariant•FABEx15J,318bpamplicon,SNPA/GPCR产物的高分辨率熔解曲线基于基因扫描的基因分型DNAwithheterocygoteSNPPCR++...TCTTTTTCCCCCGAAAAAAGGGGGDenaturationreannealing+IntercalatingfluorescentdyeIncreasingtemperature26MeltingCurvesTemperatureCGTA两种同源双链两种异源双链CATG观察到的4种双链结构杂合子扩增基因扫描高分辨率熔解分析纯合子野生型(homoduplexes)纯合子突变型(homoduplexes)杂合子案例:LPLH3基因的突变(SNPCT)72样品，PCR产物大小164bpLightCycler480HRM应用介绍基因扫描–显著降低测序成本•甘露糖结合凝集素MBL2基因序列变异分析(384个样本,扩增子长度219bp):4种最常见的基因型在图像上被分为4组;少量样本呈现另外的3种遗传变异29突变定量分析：CYP2C9目前约有16%的临床药物由其负责代谢(如华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因)portionTallele50%,1:120%,1:514%,1:710%,1:104%,1:250%144bpamplicon,SNPC/T30凝血因子VIII的突变检测•第八因子的单碱基替换导致了50%急性血友病A。•由于该基因转录本长达9kb，且外显子较小（69–262bp)，利用dHPLC或者测序检测昂贵耗时。•用HRM可筛选出90%的突变。DetectionofFactorVIIIGeneMutationsbyHigh-ResolutionMeltingAnalysis.Laurieetal.ClinChem.200731HRM法检测KRAS基因的敏感性结果扩增片段92bp，突变型质粒所占的比例分别为0%、2%、5%、10%、20%、50%、100%的混合质粒DNA系列中，HRM分析方法可以明显的检测出只含2%的突变型DNA。50%20%100%10%5%WT2%14%32不同的KRAS突变类型在HRM判读图谱中显示出与野生型不同的突变型的曲线罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断•病原体测定•肿瘤研究•突变检测•甲基化检测•基因差异表达研究主要内容34在一般正常的细胞中，CpG成分处于非甲基化的状态甲基化研究对于了解基因的调控模式以及疾病的分子生物学机制具有重要意义：发育、癌肿瘤发生、基因印迹、X染色体失活及相关遗传性疾病在特定条件下，譬如许多发育相关基因，在发育的特殊阶段去甲基化表达肿瘤的DNA甲基化改变表现为总体的甲基化水平降低与启动子区CpG岛的甲基化水平升高。抑癌基因与修复基因的甲基化导致抑癌基因沉默与修复基因失活;而总体低甲基化使反转录转座子、癌基因活化和染色体不稳定基于甲基化特定标志物的量化情况，对不同的病人进行风险水平分级DNA甲基化现象和疾病研究2.PCR扩增，脲嘧啶经PCR扩增后变为胸腺嘧啶，使甲基化差别转换为碱基序列差别TCmCU1.重硫酸盐处理已变性的DNA，未甲基化的胞嘧啶转变为脲嘧啶mCmCCU3.分析:测序，甲基化特异性PCR，引物延伸，限制性酶消化，杂交…orReal-timePCR!DNA甲基化研究的常规流程36HighQualityAssessmentofDNAMethylationinArchivalTissuesfromColorectalCancerPatientsUsingQuantitativeHigh-ResolutionMeltingAnalysis.Balic,M.etal.(2009),J.Mol.Diagn.11,102-108.在肿瘤发生过程中，超甲基化的启动是一个常见的抑制基因转录的机制，它也同时被视为肿瘤发生的特点之一。适当保存的组织是检测重要的生物标志物的重要来源。在早期癌症监测、风险分析和治疗中，DNA甲基化分析方法是一个理想的手段。使用HRM分析方法，可以稳定地检测到1%的甲基化DNA37甲基转移酶MGMT与肿瘤预见性、个体化治疗Krypuy,M.etal.Rapidhigh-throughputmethylationanalysisusingtheLightCycler®480system.Biochemica1,11–13;2008•O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶MGMT，是细胞修复DNA损伤的一种酶，可以修复由各种烷化剂造成的细胞DNA烷基化损伤•细胞中的MGMT水平决定了细胞对烷化剂的耐药程度•MGMT的甲基化程度直接反映了其表达水平罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断•病原体测定•肿瘤诊断•基因差异表达研究•早期筛查•分子指纹主要内容qPCR图谱作为肿瘤指纹用于早期筛查•早期筛查——肿瘤的恶性生长会引起血液生化环境的特征性变化，这些变化将会影响血细胞某些基因的表达。根据不同肿瘤与免疫系统的关系，对外周血细胞的表达谱进行人类全基因的表达差异分析（生物芯片），筛选出肿瘤相关表达差异基因。•乳腺癌早期诊断（荧光定量PCR法）：通过对外周血细胞的表达谱进行人类全基因组的表达差异分析，筛选乳腺癌早期诊断的基因标记物，采用实时荧光定量PCR技术，检测临床血液样本中乳腺癌标志物的表达差异，检测结果可用于乳腺癌的早期筛查和辅助诊断。qPCR图谱作为成神经细胞瘤指纹Predictingoutcomesforchildrenwithneuroblastomausingamultigene-expressionsignature.Vermeulen,J.etal.(2009),LancetOncol.10,663-671.在最大的成神经细胞瘤库（n=579）中建立、验证了大量的预后多基因表达。实时定量PCR(qPCR)检测，只需20ngRNA，使用59种预后基因和5种内参基因。这个验证结果构成的“指纹信息”可以作为一种独立的风险预测机制，使得在当前的治疗组中能鉴别出病情可能加重的病人。46荧光定量PCR技术的优点•特异性强：直接扩增特异DNA或异常基因片段•灵敏度高：可检测到极少量的DNA，有效降低漏诊率•高效省时：扩增周期短，有利于快速诊断•取材范围广：血清、