《植物生物技术概论》2

园艺植物生物工程研究所1第二章基因工程园艺植物生物工程研究所2基因工程(geneengineering)的概念基因工程也叫基因操作、遗传工程，或DNA重组技术。是按人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因（DNA分子），在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录、表达的操作。优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的限制。3园艺植物生物工程研究所理论依据不同基因具有相同的物质基础基因是可切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代4园艺植物生物工程研究所基因工程的基本过程它所涉及的过程可用“分(合成)、切、连、转、选、鉴”六个字表示。分(合成)∶指DNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。切∶即在体外将DNA进行切割，使之片段化或线性化。连∶即在体外将不同来源的DNA分子重新连接起来，构建重组DNA分子。转∶即将重组连接的DNA分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达。选∶从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；鉴∶就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定5园艺植物生物工程研究所6•基因克隆示意图园艺植物生物工程研究所7第一节DNA重组技术园艺植物生物工程研究所一、DNA的结构与功能8园艺植物生物工程研究所9脱氧核糖核苷酸分子由脱氧核糖、碱基和磷酸基团（base）组成。1.组成园艺植物生物工程研究所10多个脱氧核苷酸按此方式连接成多聚脱氧核苷酸，其一端为游离的5’磷酸基团(5'-P)，称为5’端，而另一端为游离的3’羟基(3'-OH)，称为3’端。园艺植物生物工程研究所Chargaff规则的内容所有DNA：A=T、G=C，即A+G=T+C。DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同种的DNA碱基组成不一样。对同一生物物种，DNA的碱基组成没有组织和器官的特异性。DNA的碱基组成不随年龄、营养状况及环境的改变而改变。11园艺植物生物工程研究所2.结构（1）DNA的一级结构•脱氧核苷酸在长链上的排列顺序就是DNA的一级结构。•不同种DNA之间的千差万别只是在碱基排列顺序不同。•DNA的一级结构也称为核苷酸序列或碱基序列。12园艺植物生物工程研究所（2）DNA的二级结构•DNA的二级结构即DNA双螺旋结构模型(DNADoubleHelixModel).13园艺植物生物工程研究所141952.King’sLab.UKM.H.F.Wilkins&RosalindFrankinDNA的高质量X射线衍射图园艺植物生物工程研究所151953.Watson&CrickB-DNA的右手双螺旋模型园艺植物生物工程研究所16DNA双螺旋的结构特点l两股单链糖-磷酸构成骨架，居双螺旋外侧。碱基位于双螺旋内侧，并与中心轴垂直。l每圈螺旋含10个核苷酸残基，螺距：3.4nm,直径:2nm。有两个沟：大沟和小沟。l碱基严格配对:A与T、C与G互补碱基与互补链。l由两条反向平行的脱氧多核苷酸链围绕同一中心轴构成右手双螺旋结构。园艺植物生物工程研究所17影响双螺旋结构稳定性的因素氢键(Hydrogenbond)弱键,可加热解链.磷酸酯键(phosphoesterbond),也叫离子键。强键,需酶促解链.碱基堆积力(非特异性结合力).☆磷酸骨架,氨基,酮基周围水分子间的有序排列☆Vandewaalsforce☆疏水作用力(Hydrophobicinteraction)园艺植物生物工程研究所18Z-DNAZ-DNAA-DNAB-DNADNA的分子构型（B/Z/A）比较19•由于双链DNA是靠互补配对的碱基之间的氢键维持的，因此当溶解在溶液中的双链DNA处于较高温度条件下时，因氢键断开而解链成单链DNA，此过程称为DNA变性。•DNA溶液加热到90℃时，就足以使DNA完全变性。高温变性的DNA被逐渐冷却时，分开的两条单链又会重新结合成双链DNA，此过程称为复性。园艺植物生物工程研究所DNA的变性与复性20园艺植物生物工程研究所DNA的变性与复性DNA分子杂交21园艺植物生物工程研究所•双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。•绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。•超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。22园艺植物生物工程研究所（3）DNA的三级结构23园艺植物生物工程研究所（1）DNA分子能在细胞内复制•以亲代DNA的一条单链为模板，按照碱基互补原则，合成另一条具有互补碱基的新链。•通过复制所形成的新DNA子链，含有原来亲本DNA双链分子的一条亲代链和一条新的子代链，所以DNA这种自我复制方式称为半保留复制。园艺植物生物工程研究所243.DNA的功能25园艺植物生物工程研究所园艺植物生物工程研究所26DNA的功能——起着贮存和传递遗传信息的作用。基因——基因就是DNA的功能片断，或者说基因是一段DNA顺序。（2）贮存和传递遗传信息DNA的基本功能就是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础。27园艺植物生物工程研究所DNA体外重组，首先必须获得重组和能够重组的DNA片段。如何获得DNA片段呢？28二、限制性内切酶与DNA片段化园艺植物生物工程研究所29一把特殊的剪刀——限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖园艺植物生物工程研究所30园艺植物生物工程研究所31限制性内切酶(restrictionendonuclease)是指一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适反应条件下使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH基团和5’-P基团的DNA片段。内切核酸酶有Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。1.限制性内切酶园艺植物生物工程研究所32限制性内切酶的种类园艺植物生物工程研究所（1）限制性核酸内切酶的命名•一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。前三个字母必须是斜体。•例如，从BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性内切酶称为BamH。•在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。•EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)。•EcoRIEscharichiacoliRy13first33园艺植物生物工程研究所（2）识别序列限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为6个核苷酸的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。少数限制性内切酶的识别序列由4个或者5个核苷酸对组成。34园艺植物生物工程研究所35园艺植物生物工程研究所（3）酶切位点36lDNA在限制性内切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为酶切位点，可用↓表示。l一般酶切位点在识别序列内部，如G↓GATCC；少数在识别序列两侧，如：↓GATC、CATG↓等。l一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段；l另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即黏端）的DNA片段园艺植物生物工程研究所平末端与黏性末端EcoRⅠGAATTCCTTAAG5′3′5′3′5′GCTTAAAATTCG3′3′5′粘性末端SmaⅠCCCGGGGGGCCC5′3′3′5′5′CCCGGGGGGCCC3′3′5′平头末端37园艺植物生物工程研究所3839反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成黏性末端，有利于DNA片段的重组。II型酶40园艺植物生物工程研究所41Ⅱ类酶识别序列特点同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶（CCGG)，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。同裂酶与同尾酶42园艺植物生物工程研究所同尾酶（isocaudamer）43序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。园艺植物生物工程研究所三、特异DNA片段的PCR扩增PCR技术(PolymeraseChainReaction):是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下,依赖于DNA聚合酶(Taq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步:变性、退火、延伸。以上三步为一个循环,经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。44园艺植物生物工程研究所45•1983年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）•基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制•最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR•耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪•1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术的发明园艺植物生物工程研究所46KaryB.MullisTheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。园艺植物生物工程研究所PCR技术的反应条件标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L47园艺植物生物工程研究所(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)48园艺植物生物工程研究所49温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。•反应初期，目的DNA片段呈指数形式增加；随着目的DNA的积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和平台期（25个循环）。50园艺植物生物工程研究所1.双链DNA变性51（一）PCR的反应过程园艺植物生物工程研究所522.引物与模板DNA退火园艺植物生物工程研究所533.引物延伸DNA合成园艺植物生物工程研究所544.第二轮循环的变性园艺植物生物工程研究所555.第二轮循环的引物延伸DNA合成园艺植物生物工程研究所56园艺植物生物工程研究所57PCR反应的特点特异性强灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(mg=10-6)水平简便、快速：PCR反应一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或