(植物中)淀粉酶活性的测定

(植物中)淀粉酶活性的测定一实验目的本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法。二实验原理植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，有α－淀粉酶及β－淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。α－淀粉酶和β－淀粉酶都各有其一定的特性，如β－淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β－淀粉酶，便可测定α－淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0℃加以处理，钝化α－淀粉酶，以测出β－淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5－二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3－氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽糖到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。三实验材料萌发的小麦、大麦或者豆类等（芽长1cm左右）四实验仪器和试剂1．仪器：电子天平、研钵、100mL容量瓶（1个）、50mL量筒（1个）、刻度试管[25mL（9个）、10mL（1个）]、试管6支、移液管[1mL（2支）、2mL（2支）、10mL（2支）]、离心机、恒温水浴锅、7220型分光光度计2．试剂：1％淀粉溶液、0.4mol/LNaOH、pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至1000mL；B、称取柠檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1000mL；取A液13.70mL与B液26.30mL混匀即是。3,5－二硝基水杨酸：精确称取3,5－二硝基水杨酸1g溶于20mL1mol/LNaOH中，加入50mL蒸馏水，在加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL，盖紧瓶盖，勿让CO2进入。麦芽糖标准液：称取化学纯麦芽糖0.100g溶于少量蒸馏水中仔细移入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。五操作步骤1．酶液的提取：称取萌发的水稻种子0.5g（芽长1cm左右，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入25mL刻度试管中，用水稀释至刻度，混匀后在温室下放置，每隔数分钟振荡一次，放置20分钟后离心，取上清液备用。2．α－淀粉酶活性的测定：（1）取三支试管，编号注明1支为对照管，2支为测试管。（2）于每管中各加入酶提取液1mL，在70℃恒温水浴中（水文的变化不应该超过±0.5℃），准确加热15分钟，在此期间β－淀粉酶受热钝化，取出后迅速在自来水中冷却。（3）在试管中各加入1mLpH5.6的柠檬酸缓冲液。（4）向对照管中加入4mL0.4mol/LNaOH，摇动2－3分钟，静止2分钟，以钝化酶的活性，再加入1％淀粉2mL。（5）将测定管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15分钟，再加入40℃下预热的1％淀粉溶液2mL，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温15min取出，迅速加入4mL0.4mol/LNaOH，以终止酶的活动，然后准备下一步糖的测定。3．α－淀粉酶和β－淀粉酶总活性的测定：取上述酶提取液1mL，放入刻度试管中，用蒸馏水稀释至10mL（稀释程度视酶活性的大小而定）。混合均匀后，取3支试管，1支为对照管，2支为测定管，各加入稀释的酶液1mL、pH5.6的柠檬酸缓冲液1mL。以上步骤重复α－淀粉酶测定的第（4）及（5）的操作，同样准备糖的测定。4．麦芽糖的测定：（1）标准曲线的制作：取25mL刻度试管5个编写号分别加入麦芽糖标准液（1mg/mL）0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL，然后于各管加入蒸馏水使溶液为2mL，再各加3,5-二硝基水杨酸试剂2mL，置沸水中准确煮5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL，混匀。用7220型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录光密度，以光密度为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。（2）样品的测定取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1mL，分别加入25mL刻度管中，再加入1mL的水，3,5-二硝基水杨酸试剂2mL，混匀置沸水中准确煮5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL，混匀。用7220型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录吸光度，从麦芽糖标准曲线中计算出麦芽糖含量，用以表示酶的活性。六结果计算A:α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量（mg）A1:α-淀粉酶对照管中麦芽糖量（mg）B:α+β-淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量（mg）B1:α+β-淀粉酶的对照管中的麦芽糖量（mg）