实验十五脂质体的制备

1/4实验十五脂质体的制备一、目的要求1．掌握薄膜分散法和逆相蒸发法制备脂质体的工艺。2．掌握用阳离子交换树脂法测定小檗碱脂质体包封率的方法。3．熟悉脂质体形成的原理及其作用特点。二、实验提要1.含义脂质体是指药物包封于类脂双分子层形成的薄膜中所制成的超微型球状的药物载体。根据类脂双分子层的层数的不同，脂质体可分为单室脂质体（含大、小单室）和多室脂质体。b5E2RGbC2.制备要点脂质体的制法有多种，应根据药物的性质或需要进行选择。经典的薄膜分散法可形成多室脂质体，再经超声处理可得到小单室脂质体。此法操作简便，但包封率较低。注入法有乙醚注入法和乙醇注入法两种，乙醚注入法是将磷脂、胆固醇和脂溶性药物及抗氧剂等溶于适量的乙醚中，在搅拌下慢慢滴于55℃~65℃水性介质中，蒸去乙醚，继续搅拌1小时～2小时，即可形成脂质体。此法适于实验室小量制备脂质体。乙醇注入法制备脂质体，脂质体混悬液一般可保留10%～20%乙醇。此法适用于不耐热的药物。反相蒸发法是制备多层脂质体或大单室脂质体的方法，此法包封率高。冷冻干燥法适用于水中不稳定药物脂质体的制备。熔融法制备的脂质体为多相脂质体，其性质稳定，可加热灭菌。p1EanqFD3.质量评价指标有粒径、粒径分布和包封率等。包封率是评价脂质体内在质量的一个重要指标，常见的包封率测定方法有分子筛法、超速离心法、超滤膜法和阳离子交换树脂法等。阳离子交换树脂法是利用离子交换作用，将带正电荷的未包进脂质体中的药物（即游离药物），如本实验中的游离小檗碱，吸附除去。而包封于脂质体中的药物，由于脂质体带负电荷，不被阳离子交换树脂吸附，从而达到分离的目的，用以测定包封率。DXDiTa9E4.其他制备脂质体的材料主要有磷脂和胆固醇。磷脂有天然磷脂（豆磷脂、卵磷脂等）和合成磷脂（二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等）。胆固醇为两亲性物质，是常用的附加剂，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体。其作用是调节双分子层的流动性，减低脂质体膜的通透性。其他附加剂如十八胺、磷脂酸等，具有改变脂质体表面电荷的性质。RTCrpUDG2/4制备脂质体可分为三类：小单室（层）脂质体，粒径在20～50nm，凡经超声波处理的脂质体混悬液，绝大部分为小单室脂质体，多室（层）脂质体，粒径约为400～3500nm；大单室脂质体，粒径约为200～1000nm，用乙醚注入法制备的脂质体多属这一类。5PCzVD7H-----脂质体混悬液中总的药物浓度-----未包入脂质体中的药物浓影响脂质体包封率的因素有多种，如磷脂质的种类，组成比例，制备方法及介质的离子强度等。包封率的测定方法有凝胶过滤法，常用凝胶为SephadexG50、G100或者说Sephrouse4B、6B。超速离心法、透析法、超滤膜过滤法等，根据条件加以选择。jLBHrnAI三、实验内容盐酸小檗碱脂质体的制备【处方】豆磷脂0.75g乙醚35mLxHAQX74J胆固醇0.25g盐酸小檗碱溶液（1mg•mL-1）25mL共制成脂质体25mL【制法】1．磷酸盐缓冲液（PBS）的配制称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）3.7g与磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）20g，加蒸馏水适量，加热溶解，稀释成1000mL，即得0.067mol•L-1的磷酸盐缓冲液（pH约为5.7）。LDAYtRyK2．盐酸小檗碱溶液的配制称取盐酸小檗碱适量，用0.067mol•mL-1磷酸盐缓冲液配成1mg•mL-1和3mg•mL-1的两种浓度药液。Zzz6ZB2L3．盐酸小檗碱脂质体的制备称取处方量豆磷脂、胆固醇置150mL小烧杯中，加入35mL乙醚，在磁力搅拌器上搅拌溶解，加入盐酸小檗碱溶液（1mg•mL-1）25mL，继续搅拌，乳化，直到乙醚挥尽成为黄色的乳状液，即为小檗碱脂质体。dvzfvkwM本品在显微镜下观察，为多层囊状或多层圆球，【作用与用途】抗菌药，制成多种剂型，用于癌症的治疗。3/4【质量检查】1.性状为多层囊状或多层圆球，大部分粒径在0.7μm~1.2μm之间。2.包封率的测定(1)阳离子交换树脂分离柱的制备：称取已处理好的阳离子交换树脂约1.5g，装于底部已垫有少量玻璃棉的5mL注射器筒中，加入PBS水化阳离子交换树脂，自然滴尽PBS，即得。rqyn14ZN(2)柱分离度的考察：①空白脂质体制备称取豆磷脂0.9g、胆固醇0.3g于小烧杯中，加乙醚10mL，搅拌使溶解，旋转该小烧杯使乙醚在杯壁成膜，用洗耳球吹风，将乙醚挥去。另取磷酸盐缓冲液30mL于小烧杯中，置磁力搅拌器上，加热至55℃~65℃保温10分钟，再在同样温度下，搅拌30~60分钟（溶液体积少，补加PBS），即得。EmxvxOtO②盐酸小檗碱与空白脂质体混合液的制备精密量取3mg•mL-1的盐酸盐酸小檗碱溶液0.1mL，置小试管中，加入0.2mL空白脂质体，混匀，即得。SixE2yXP③对照品溶液的制备取②中混合液0.1mL置10mL量瓶中，加入60%乙醇6mL，振摇使之溶解，再加PBS至刻度，摇匀，得对照品溶液。6ewMyirQ④样品溶液的制备取②中混合液0.1mL加至分离柱顶部，待顶部的液体消失后，放置5分钟，仔细加入PBS（注意不能将柱顶部离子交换树脂冲散），进行洗脱（约需1.5mL～2mLPBS），同时收集洗脱液于10mL量瓶中，加入95%乙醇6mL振摇使之溶解，再加PBS至刻度，摇匀、过滤，弃去初滤液，取续滤液为样品溶液。kavU42VR⑤空白溶剂的配制取95%乙醇30mL，置50mL量瓶中，加PBS至刻度，摇匀，即得。⑥吸收度的测定：以空白溶剂为对照，在345nm波长处分别测定样品溶液与对照品溶液的吸收度。计算柱分离度。分离度要求大于0.95。y6v3ALoS式中，A样——样品溶液的吸收度；A对———对照品溶液的吸收度；2.5——对照品溶液的稀释倍数。（3）包封率的测定：精密称取盐酸小檗碱脂质体0.1mL两份，一份置10mL量瓶中，4/4按“柱分离度考察”项下②进行操作；另一份置于分离柱顶部，按“柱分离度考察”项下③进行操作，所得溶液于345nm波长处分别测定吸收度，按下式计算包封率。M2ub6vST式中，AL：通过分离柱后收离脂质体中盐酸小檗碱的吸收度Ar：盐酸小檗碱脂质体中总的药物吸收度。【制剂评注】（1）制备用磷脂和胆固醇溶液应澄清，若有杂质应滤过除去。（2）如果室温较低，可用吸耳球轻吹乙醚液面，加速乙醚的挥发，实验过程中禁止用火。（3）如果制得的脂质体体积少于5ml，加蒸馏水调整至5ml。四．思考题1.脂质体作为抗癌药物载体的机理和特点有哪些？2.影响脂质体形成的因素有哪些？3.抗癌药物制成脂质体制剂有何意义？4．注入法制备脂质体成败的关键是什么？5．制备脂质体时加入胆固醇的目的是什么？