致泻大肠埃希式菌的检验

致泻大肠埃希氏菌及其检验一、目的与要求1、学习掌握致泻性大肠埃希氏菌检验的基本原理和方法；2、了解动物性食品检验致泻性大肠埃希氏菌的意义。二、生物学特性俗称大肠杆菌1、革兰氏阴性菌2、杆状、两端钝圆、周生鞭毛、无荚膜3、需氧及兼性厌氧4、能在普通琼脂上生长普通大肠埃希氏菌EscherichiaColi扫描照片三、污染途径污染水源和土壤，进而污染食物肉类食品乳制品水产品等四、致病性肠道内感染腹泻、食物中毒、肠热症肠道外感染鼠疫（烈性传染病）、泌尿道感染、肺炎、脑膜炎、伤口化脓、败血症物学检验五、微生检样25g+营养肉汤225mL乳糖发酵阳性的发酵管36℃±1℃6h肠道菌增菌肉汤麦康凯EMB36℃±1℃18h~24h乳糖发酵或不发酵的菌落3个~5个，氧化酶—，革兰氏阴性杆菌TSI、靛基质、pH7.2尿素KCN、赖氨酸、动力TSI底层+，H2S—，KCN—，尿素—血清学试验非左述的各种反应结果非大肠埃希氏菌报告（一）检验步骤检样→样品处理→增菌培养→伊红美蓝（EMB）平板分离培养→生化鉴定→血清学鉴定→报告1、增菌培养以无菌手续称取检样25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36±1℃培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。2、分离培养将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培养18～24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。EMB培养基黑紫色或紫红色，圆形，边缘整齐，表面光滑，湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽。菌落特征：3、生化检验自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸,H2S阴性,KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌.TSI底层不产酸或H2S、KCN、尿素有任何一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶实验或革蓝氏染色镜检。三糖铁琼脂试验：只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。细菌分解含硫氨基酸，产生H2S，与FeSO4发生反应形成FeS。大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。靛基质试验：细菌分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对二氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而成红色。脲酶试验：细菌分解尿素产生两分子氨，使培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有脲酶。动力试验：有动力的细菌会沿着穿刺线扩散生长。赖氨酸脱羧试验：细菌从赖氨酸脱去羧基（-COOH），导致培养基pH变碱，指示剂溴麝香草酚蓝就显示出蓝色，试验结果为阳性，如果细菌不能脱酸，培养基不变则为黄色。4、血清学试验假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群。如与某一单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。多价血清单价血清单价血清单价血清单价血清OK多价1O55：K59（B5）O86：K61（B7）O111：K58（B4）O127a：K63（B8）OK多价2O26：K60（B6）O125：K70（B15）O126：K71（B16）O128：K67（B12）OK多价3O44：K74（L）O114：K90（B）O119：K69（B14）O142：K86（B）5、结果报告根据以上生化试验和血清学试验结果作出报告。