4.第4章-血凝分析

第四章血凝分析主讲：周振华第一节血凝分析理论知识•一、血管壁的止血功能(P153)•二、血小板的止血功能(P155)•三、抗凝及纤溶系统(P156)一、生理性止血的基本过程1、血管收缩2、血小板血栓形成3、血液凝固血液凝固是由凝血因子按一定顺序相继激活而生成的凝血酶最终使纤维蛋白原变为纤维蛋白的过程。因此，凝血过程可分为凝血酶原酶复合物的形成、凝血酶原的激活和纤维蛋白的生成三个基本步骤。出血与凝血机制出血与凝血机制生理性止血过程示意图5HT：5羟色胺，TXA2:血栓烷A2二:凝血过程凝血酶原酶复合物可通过内源性凝血途径和外源性凝血途径生成。内源性内源性((接触因子接触因子))途径途径外源性外源性((组织因子组织因子))途径途径XIaXIaXIIaXIIaIXaIXaXaXaIIaIIaVIIIaVIIIaVaVaVIIaVIIa组织因子组织因子纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白纤维蛋白激活激活激活激活激活激活激活激活激活激活激活激活胶原凝血途径（简化）371298纤维蛋白原：1Fibrin21110+5凝血酶原第二节仪器检测原理•血凝仪可进行血栓与止血的实验室检查。•可为出血性和血栓性疾病的诊断、溶栓以及抗凝治疗的监测及疗效观察提供有价值的指标。•血栓与止血的基本检测指标：PT凝血酶原时间APTT活化部分凝血活酶时间FIB纤维蛋白原TT凝血酶时间D-DimerD-二聚体AT-Ⅲ抗凝血酶ⅢⅡⅤⅦⅩ内原性凝血因子ⅧⅣⅥⅫ外原性凝血因子PC蛋白CPS蛋白S血凝仪基本检测方法凝固法底物显色法乳胶凝集法免疫法主要检测方法血凝仪检测原理（二）底物显色法生物化学法：以底物释放产色基团量的变化测定有关因子（一）凝固法生物物理法电流法——纤维蛋白原——纤维蛋白——导电光学法散射比浊法——凝固过程中散射光变化透射比浊法——凝固过程中吸光度变化浊度变化光度变化双磁路磁珠法——钢珠振幅衰减程度判断终点光电磁珠法——吸光度衰减程度判断终点（三）免疫学法抗原抗体免疫扩散法火箭电泳双向免疫电泳免疫比浊ELISA法直接比浊乳胶比浊散射比浊透射比浊•生物物理法生物物理法亦可称为凝固法。通过检测血浆在凝血激活剂的作用下光、电、机械运动等一系列变化，再由计算机采集分析数据得出最终结果。由于是检测血浆在凝固过程中的物理变化，因此该法也可称为生物物理法。电流法(已淘汰)当一定时间后血浆中纤维蛋白形成，电极向上移动时可钩起纤维蛋白丝。此时由于纤维蛋白丝的存在，电路仍处于接通状态即可判断为凝固终点。散射比浊法散射比浊法当待测血浆中纤维蛋白凝块形成时，来自发光二极管的光被其散射。接收器接收散射光并将其转变成电信号。•生物物理法光学法光学测定法是通过测定血浆在加入激活剂后浊度的变化来测定测定凝血时间的。可分为散射比浊法和透射比浊法两种。散射比浊法由经过放大处理后的电信号产生的血浆凝固曲线如图所示。取整个测量过程中随时间变化的散射光强度为100%，计算从测定开始至散射光强度增加到50%时所对应的时间为凝固点。透射比浊法透射比浊法的光源与接收器呈直线排列。当待测血浆中纤维蛋白凝块形成时，来自发光源的光强度被其吸收。接收器将变化的光强度转变成电信号。仪器的数据处理部分连续记录样品的吸光度变化曲线，计算出单位时间内吸光度的变化量，并以每分钟吸光度的变化量来报告结果。•生物物理法双磁路磁珠法在待测血浆中加入小铁珠，如图所示。测试杯两侧的驱动线圈产生一恒定的交变电磁场，使杯内的小钢珠保持等幅运动。凝血激活剂加入后，纤维蛋白的产生增多，血浆的粘稠度增加，迫使小钢珠的运动幅度逐步减弱。当运动幅度衰减到先前的50%时，可确定为凝固终点。•磁珠法检测系统简介磁珠法检测用于凝固法是Stago的专利技术，如图所示。一旦被测血浆开始凝固（加入激活试剂）血浆黏度增加使钢球的运动速度减慢，振幅减小。测量线圈检测到此振幅的变化并通过计算得到凝血时间。•生物化学法这类方法主要是通过测定产色物质的吸光度变化，以推算待测物质的含量。这类方法也称为底物显色法。人工合成可以被待测凝血活酶催化裂解的多肽底物，且多肽底物连接上产色物质。在检测过程中产色物质可被解离下来，使被检样品中出现颜色变化，根据颜色变化可推算出被检凝血活酶的活性。产色物质一般选用连接对硝基苯胺（PNA）。游离的PNA呈黄色，其测定波长选用405nm。•生物化学法凝血分析仪使用产色物质在检测血栓／止血指标时的生化反应对酶的检测如下所示：在含酶的样品中直接加入合成物质，因为酶可裂解合成物质释放PNA，监测由于PNA释放而导致被检样品在405nm处光吸收的变化，就可推算样品中酶的活性。如对凝血酶、纤溶酶等的检测凝血酶样本多肽+PNA合成物质间接得到酶的含量光电比色•免疫学方法免疫学方法是以被检测物质作为抗原，然后用免疫动物的方法制备相应的抗体，利用抗原抗体的特异性结合反应来对被检测物质进行定量检测。自动凝血仪多采用免疫比浊法。三、血凝仪的基本结构1.半自动血凝仪的基本结构样本预温槽试剂预温槽加样器检测系统（光、磁）微机2、全自动血凝仪的基本结构1.样本传送及处理装置样本传送及处理装置通常包括：自动进样系统、自动穿盖系统、及样本条形码扫描系统。2.试剂冷藏及测试杯供应系统试剂冷藏位可以提供几十个试剂位置并提供一个8-10度低温环境。测试杯供应系统则为每一个测试提供测试杯，并在测试完成后将测试杯自动抛弃。3.样本及试剂分配系统样本及试剂分配系统通常包括：样本臂、试剂臂及样本注射器、试剂注射器，样本及试剂针，冲洗池。4.检测系统仪器检测系统通常包括两种以上的检测方法：双磁路磁珠法、散射比浊法、透射比浊法、底物显色法等等。5.计算机系统系统软件控制凝血仪的所有工作过程，并将检测到的数据进行分析处理最终得到测试结果。对检测结果进行存储、质控统计等工作6.输出设备通过计算机屏幕或打印机输出测试结果。四、血凝仪的检测项目1.凝血系统的检测P1652.抗凝系统的检测3.纤维蛋白溶解系统检测4.临床用药的监测①多方法、多功能、快速高效；②智能化程度高，软件开发进一步完善；③全自动血凝分析仪工作站；④床旁分析；⑤在临床中的应用日趋广泛。主要体现在：五、血凝仪的发展和应用展望第三节血凝分析临床应用凝血四项：PT、APTT、Fbg、TT•检测出血性疾病•检测血栓性疾病•手术前止血功能检查•临床抗凝治疗监测•弥漫性血管内凝血的检测标本采集•病人准备：药物影响。抗凝药、抗血小板药、溶栓防栓药，如APC、避孕药。抗凝：抗凝剂：109mmol/L枸橼酸钠1:9试管：真空抗凝管、塑料试管注意事项：采血顺利、混匀充分；立即送检，2h完成。反应总原理FibrinogenFibrinPT(凝血酶原时间)APTT（活化部分凝血活酶时间）Fib（纤维蛋白原）TT（凝血酶时间）病人血浆不同反应试剂检测血浆凝固的时间凝血酶原时间PT反映外源性凝血途径中II、V、VII、X因子水平的实验。凝血酶原酶复合物反映外源凝血的筛选实验1、原理：一步凝固法：在抗凝血中，加入过量的组织凝血活酶（含TF）和适量的钙离子，即可满足外源性凝血的全部条件。从加入试剂到血浆到血浆开始凝固所需的时间即血浆凝血酶原时间。参考范围平均值为（12±1）s，超过正常对照值3s为异常。凝固时间血浆组织凝血活酶（TF）Ca2+PT的临床意义PT延长：先天凝血因子异常,如I、II、V、VII、X因子中某一项或几项因子水平缺乏。可用于外源凝血因子缺陷的筛查。后天凝血因子缺乏，如肝脏疾病、肝硬化（大多数凝血因子由肝脏合成）、维生素K缺乏（可见于阻塞性黄疸）。可用作肝脏蛋白质合成功能的检测手段。DIC后期(由于大量消耗和产生的FDP拮抗凝血酶的作用使PT延长，因此可用作DIC的检测）、口服抗凝药（可密定、华法林，PT最敏感）、肝素等。PT缩短：高凝状态：DIC早期，心梗、脑血栓形成，深静脉血栓形成，口服避孕药，PT时间缩短，但并不常见。1.凝血酶原时间比值（PTR）PTR=PT受检/PT对照参考值为0.85－1.152.国际标准化比值（INR）（WHO规定口服抗凝剂患者的报告方式）INR=PTRISI，参考值为0.８-1.５ISI：国际敏感指数活化部份凝血活酶时间APTT是反映内源性凝血途径中VIII、IX、XI、XII因子水平的实验，APTT只反映因子水平，并不反映凝血因子是否活化。反映内源凝血的筛选实验•原理：在抗凝血浆中，加入过量的活化接触因子激活剂（如白陶土）和部分凝血活酶（代替血小板磷脂），再加入适量的钙离子即可满足内源凝血的全部条件。从加入钙离子到血浆开始凝固所需的时间即为活化部分凝血活酶时间。•参考范围32-43秒，受检者较正常对照值延长10s以上才有意义。白陶土（接触因子激活剂）部分凝血活酶（脑磷脂）Ca2+凝固时间血浆APTT的临床意义APTT延长：Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ因子中某一项或几项因子水平缺乏；血友病甲、血友病乙。肝脏疾病、肝硬化、DIC后期继发纤溶亢进时，敏感性略差。肝素治疗的监护：一般在肝素治疗期间，APTT维持在正常对照的1.5-2.5倍适宜。溶栓治疗时，ATPP与PT、TT应将值控制在正常值的2倍。APTT缩短：见于血液呈高凝状态，DIC早期、血栓前状态、血栓性疾病。血浆纤维蛋白原测定Fbg检测原理：血浆中加入过量的凝血酶，使纤维蛋白原变成纤维蛋白。参考值：2-4g/L[意义]减少：1．先天性纤维蛋白原缺乏症，原发性Fg减少、原发纤溶2．DIC晚期（消耗过多）3．严重肝病增高：1．高凝状态：血栓性疾病，急性炎症、手术创伤、恶性肿瘤等(Fg是急性时相蛋白)2．生理性：部分正常老人，妊娠晚期凝血酶时间TT反映共同途径是否存在抗凝或纤溶亢进血浆凝固时间标准凝血酶原理：在抗凝血浆中加入“标准化”凝血酶溶液，直接将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，测定血浆开始凝固所需的时间。参考范围：16-18秒，以超过正常对照3秒以上为有病理意义TT的临床意义TT延长1、血浆纤维蛋白原水平低下，如低(无)纤维蛋白原血症，异常纤维蛋白原血症等。(FIB减少时TT延长)2、循环中有抗凝血酶活性增高，如FDP存在、高肝素血症、抗凝血酶Ⅲ活性增高等。3、肝硬化、肝肿瘤、DIC、异常抗凝物质增多。TT缩短较罕见，异常纤维蛋白血症、巨球蛋白血症可缩短。无特别临床意义用链激酶，尿激酶作溶栓治疗时，可用TT作为监护指标，以控制在正常值的2-5倍为宜。