质粒的转化及转染

质粒的转化转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种；转化的研究不但在理论上有重要意义，而且在基因工程中是将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种重要手段。质粒转化的目的：将质粒转入细菌内以便获得更多的质粒，达到扩增的目的。质粒转化操作步骤：（热激法）1、从－80℃冰箱中取出感受态的细菌在冰上融化。（感受态下的细菌更容易接受外源性的DNA）2、打开大实验室（千万不可拿进细胞房，天敌）的细菌专用超净操作台的紫外灯灭菌10min。3、打开水浴锅加热，温度设置为42℃。4、取若干EP管，标记后，每EP管中加入50μL的菌液。如質粒難抽，則加大用量。5、每EP管加入2.5μL的质粒后打匀，动作要轻柔，感受态细菌比较脆弱。6、将EP管放在冰上孵育25min。7、将EP管插入浮萍放入42℃水浴锅加热60s（要求时间绝对精确）。8、将EP管插入冰块90s。9、每EP管加入1ml细菌培养基后放入大摇床上摇45min（大摇床带有加热功能，温度为37℃）。10、将Amp细菌培养板（培养基预先加入Amp）放入细菌培养箱中加热至37℃。11、将枪头预先折弯，吸入菌液后均匀涂在细菌培养板上。（每盘100μ）12、待液体稍干后将细菌培养板倒置放入细菌培养箱中12—16h。（过夜）（倒置的目的是为了液体影响细菌生长，另外液体影响观察单克隆体）Amp青霉素（氨苄青霉素Ampicillin）：目的并不是为了灭菌，Amp本身就是抗生素，而是用它来筛菌。是一种抗生素。为广谱半合成青霉素，毒性极低。抗菌谱与青霉素相似，对青霉素敏感的细菌效力较低，对草绿色链球菌的抗菌作用与青霉素相仿或略强。对白喉杆菌、破伤风杆菌和放线菌其效能基本和青霉素相同。对肠球菌及李司忒菌的作用则优于苄青霉素。对耐药葡萄球菌及其它能产生青霉素酶的细菌均无抗菌作用。对革兰阴性菌有效，但易产生耐药性。Kana挑单克隆操作步骤：（小摇）1、准备小摇管（一般用15ml离心管）：做好标记后每管加入：3ml细菌培养基+3μLAmp（1:1000比例，目的是为了杀死假阳性的克隆细菌）2、在细菌培养板上用小枪头挑单个菌落入小摇管。（为了使得手不抖动，最好将手紧贴操作台的玻璃面；一旦发觉枪头沾有多个菌落，要立刻弃之不用）3、用封口胶松松地封好瓶口放入大摇床，37℃摇12-16h。（瓶盖不要拧紧，保证瓶内与瓶外的空气相流通，使得细菌能够有充足O2的供应）LBBrothMedium培养基：由酵母菌、胰蛋白酶、NaCl组成。（很香）注意事项1：15ml离心管里只加入3ml的细菌培养及的原因是使得细菌能够与更多的空气相接触。注意事项2：放入摇床摇的目的是为了使得细菌充分接触O2，帮助它们良好生长。注意事项3：细菌培养先小摇后大摇的原因，。细菌生长曲线细菌培养板制备操作步骤：（Amp）1、每培养盘——20ml去离子水+0.8gLBBrothAgar(soe)一般配10盘200ml去离子水+8gLBBrothAgar(soe)2、配好后的培养基放入高压灭菌锅灭菌。3、待烧瓶温度降到人体适宜温度之后，加入200μLAmp（1:1000比例；要在培养基凝固前加入混匀）4、找出细菌培养板，正反面皆做好标记（防止盖子拿错，因为后来细菌生长时需倒置，只标记一边容易混淆），抗性+制备者+日期（一般1个月内有效）。5、每培养板加入20ml的已加入Amp的培养基，等待约30min使之凝固。（不能有气泡，用长枪加）6、用封口胶封好细菌培养板放入细菌培养箱，过夜（12-16h）看是否长细菌。如果不长则可以使用。方法2，现在培养皿里加入Amp，然后再加入，如此如果后来凝固的话，可以放到微波炉里加热高压灭菌锅的使用注意事项：1、看锅内和锅外蒸汽收集壶的水位：锅内的去离子水要没过下面的八角形金属板，锅外的蒸汽收集壶的水位要介于High和Low之间。2、开启高压灭菌锅灭菌后，要等到温度低于60℃方可开启。步骤：（大摇）1、用三角瓶制备细菌培养基：200ml去离子水+5gLBBrothMedium培养基（1:40重量比例）。2、用锡箔封好瓶口，放入高压灭菌锅灭菌（一般时长2h，锡箔一定要尽量压严密，防止细菌进入）。3、标记灭菌后的三角瓶，每瓶在其内加入200μLAmp。4、从小摇管内吸取1ml菌液进入大摇瓶（三角瓶），打匀放入大摇箱，12-16h