原核表达

原核表达（七天速成）南京农业大学于岩飞李权2013年9月最先学习原核表达的重要性首先：实验室主要是核酸实验和蛋白实验，原核表达是核酸和蛋白实验的基础，涵盖了很多基本实验操作，是新生熟悉实验室基本实验流程和操作的最佳入手实验。包括PCR、接菌、转化、连接、酶切、提质粒、胶回收和纯化蛋白等许多最基本的实验。其次：我们实验室主要是做比较基因组学和比较蛋白组学的研究，原核表达是我们实验研究的基础，我们会经常表达蛋白，所以原核表达就显得尤其重要，原核表达还是缺失的基础，后面我们会做缺失实验。再者：原核表达出来的蛋白是很多实验的基础，可以做ELISA、疫苗、检测免疫原性等等。↓↓transcriptiontranslationreplication亚单位疫苗的研究免疫原性检测毒力因子研究ELISA实验与细胞受体相互作用机理的研究原核表达蛋白的用途原核表达流程大纲（一）引物设计（二）获得目的基因（0.5天）（三）构建重组表达载体(0.5天)（四）获得含重组表达质粒的表达菌种（4天）（五）诱导表达、蛋白纯化与跑胶（2天）↓根据目的片段序列设计引物目的片段和质粒胶回收↓PCR目的片段胶回收↓↓目的片段和质粒分别双酶切↓目的片段和质粒进行连接↓↓连接产物导入DH5α转化提质粒测序，双酶切鉴定挑单菌落，Amp＋LB试管摇浑PCR鉴定选取阳性Amp＋LB试管扩大培养将质粒导入BL21转化涂Amp＋LB平板IPTG诱导表达纯化出目的蛋白涂Amp＋LB平板↓↓↓↓↓挑单菌落，Amp＋LB试管摇浑连接产物导入DH5α转化↓↓↓↓PCR鉴定，双酶切鉴定↓选取阳性Amp＋LB试管扩大培养↓↓↓原核表达流程图（一）引物设计鸭疫里氏杆菌（Riemerellaanatipestifer）ompA实例分析引物（表达引物）设计原则1.目的片段一般为一个完整的阅读框，起始密码子：AUG，GUG,UUG开始，终止密码子UAA,UAG,UGA结束。片段长度为3的倍数，不能移码2.引物长度一般在15-30个碱基之间3.引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃Tm=4（G+C）+2（A+T）4.引物3′端不能选择A，最好选择T5.碱基要随机分布6.引物自身及引物之间不应存在互补序列7.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低8.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰9.扩增产物的单链不能形成二级结构10.引物应具有特异性引物设计原则常用引物设计软件PremierPrimer5.0Oligo6.0VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPremierPrimer5.0主要功能:1.自动搜索2.引物设计3.限制性内切酶位点分析4.DNA基元(motif)查找5.同源性分析Oligo6.01.功能较PremierPrimer5.0更为单一，主要是引物设计及引物评价2.常与PremierPrimer5.0联合使用进行原核表达所用引物的设计登录NCBI：共１１６４ｂｐ，按照把各位数字相加，除以３得整数，即可认为这一序列能编码完整的氨基酸序列将基因序列复制粘贴到软件内并保存将DNASequence翻译成氨基酸序列Control+A选中DNASequence,点击“Goodies”“TranslateDNA”查看有无信号肽（SignalPeptide）SignalP3.0Server:打开Oligo6.0点击“ｃｈａｎｇｅ”＞＞＞＞“CurrentoligolengthＦ９”点击“Ａｎａｌｙｚｅ”＞＞＞＞“ＰＣＲＡｌｔ＋Ｐ”点击“Ａｎａｌｙｚｅ”＞＞＞＞“ＦａｌｓｅＰｒｉｍｉｎｇｓｉｔｅｓ”＞“Ｕｐｐｅｒｐｒｉｍｅｒ”下拉滚动条，下一方块中的数值要求同上同样的操作查看”FalsePrimingSites”选项中“LowerPrimer”的各项数值是否合适点击“Edit”“UpperPrimerAlt+U”和“LowerPrimerAlt+L”查找酶切位点打开PrimerPremier“File”“New”“NewDNASquence”引物信息保存方式下（二）获得目的基因1.加ddH₂O溶解引物，稍微离心。2.以新鲜菌液为模板，50ul体系PCR。3.PCR产物跑电泳，胶回收（试剂盒），测浓度。Mix25ulUp-primer2ulLow-primer2ul模板4ulddH₂O17ul程序94℃5min94℃30sTm30s72℃t(1000bp—1min)72℃10min16℃保存30-35循环（三）构建重组表达载体1.目的片段和质粒分别双酶切。BamH1最适温度是30℃，其他酶一般为37℃。E11ulE21ul10xbuffer2ul目的基因≤1ugV≤1ugx1000/浓度（ng/ul）ddH₂O补足20ul2.胶回收酶切产物，测浓度。3.连接酶切后目的片段和质粒，16℃过夜。T4DNALigase1ul10xT4DNALigasebuffer2.5u目的片段【长度（bp）x0.3x0.66/浓度】x2质粒【长度（bp）x0.03x0.66/浓度】x2ddH₂O补足25ul（四）获得含重组表达质粒的表达菌种1.转化将重组质粒导入DH5α。（1）将DH5α（BL21同理）冰上融化，5ul/10ul连接产物+50ul/100ulDH5α,冰浴30min。（2）42℃热激90ｓ，冰浴2min30s。（3）超净台加1mlLB，37℃100rpm50min-1h。（4）4000rpm离心2min，弃上清，余约100ul重悬。（5）涂LBAmp+平板，37℃过夜。2.挑单菌落于EP管，PCR鉴定，阳性者接菌于试管扩大培养。3.阳性菌提重组质粒（试剂盒），测序和双酶切鉴定，完全正确后冻存。4.将重组质粒转化到BL21。5.挑单菌落于EP管，PCR鉴定，阳性者接菌于试管扩大培养。6.阳性菌提重组质粒，双酶切鉴定，正确后冻存。（五）诱导表达、蛋白纯化与跑胶1.含有重组质粒2mlBL21+200mlLB+200ulAmp+2.37℃，180rpm摇2.5-3h，OD值大约0.4-0.6，加IPTG，然后再37℃摇5h左右。3.用50ml离心管4℃8000rpm离心10min,弃上清。4.用适量PBS重悬，离心，PBS再重悬，离心，上清溶解buffer重悬。5.超声破碎，200W左右，100-300次。6.4℃8000rpm离心10min。7.上清倒入干净的50ml离心管中，2mlPBS重悬包涵体。8.16ul上清+4ul的5xSDSloadingbuffer16ul包涵体+4ul的5xSDSloadingbuffer9.煮沸10min,跑蛋白胶确定表达蛋白是在上清还是在包涵体。若蛋白在包涵体中1.将PBS（4ml）重悬的沉淀分装在两个2mlEP管中，12000rpm，15min。2.弃上清，每管用1.5ml8M包涵体溶解buffer重悬。3.30℃水溶60min，期间经常震荡。4.12000rpm，15min，收集上清弃沉淀。5.将含有蛋白的上清用0.45um滤器过滤。6.用10ml包涵体洗脱buffer过柱。7.用5ml20%乙醇过柱。8.用5ml的蒸馏水过柱。9.用5ml的包涵体溶解buffer1ml/min过柱。10.将滤好的蛋白液过柱（尽量慢），收集滤出液。11.用10ml的包涵体溶解buffer1ml/min过柱，收集滤出液。12.用5ml包涵体洗脱buffer洗柱，收集滤出液。（标号，每管1ml）13.用10ml的包涵体溶解buffer1ml/min过柱。14.用5ml20%乙醇过柱。若蛋白在上清中1.将含有蛋白的上清用0.45um滤器过滤。2.用10ml上清洗脱buffer过柱。3.用5ml20%乙醇过柱。4.用5ml的蒸馏水过柱。5.用5ml的上清溶解buffer1ml/min过柱。6.将滤好的蛋白液过柱（尽量慢），收集滤出液。7.用10ml的上清溶解buffer1ml/min过柱，收集滤出液。8.用5ml上清洗脱buffer洗柱，收集滤出液。（标号，每管1ml）9.用10ml的上清溶解buffer1ml/min过柱。10.用5ml20%乙醇过柱。所有过柱液体都要用0.22um滤器过滤。所有过柱蛋白都要用0.45um滤器过滤。注意