二章节菌种与种扩大培养

第二章菌种与种子扩大培养本章讲述内容第一节微生物工业用菌种第二节种子扩大培养第一节微生物工业用菌种一、菌种的分离筛选1、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。2、分离思路新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目的菌。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。3、新种分离与筛选的步骤（1）采样采样对象：以采集土壤为主。采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采取土壤样品要考虑的几个问题土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗性真菌。离地面5~20cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含菌量最高。采土季节以春秋两季最好。采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、地点、植被情况等。多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分布平均情况（2）增殖培养含有目的菌较多的土样不需要富集培养如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖，从而提高它们在样品中的比例，便于分离。富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体中比例上升的目的。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通过大量艰苦的工作筛选取得。（3）培养分离尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。稀释分离法•稀释倒平板法•平板涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。•划线分离法——平板划线法（4）筛选Ⅰ、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物筛选出来的过程。常用的初选方法：•水解酶产生菌的筛选：将酶的作用底物加在培养基中，接种后适温培养，根据菌苔周围是否产生水解圈筛选出水解酶产生菌。一般采用平板筛选。•拮抗菌的筛选—对峙培养：将病原指示菌与待测菌株相对接种在平板上适温培养，根据病原菌的生长情况筛选出拮抗性菌株。分初筛、复筛。2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取发酵滤液进行活力测定。Ⅱ、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的生产能力强弱的过程。•复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法进行测定。•复筛过程中，要结合培养条件进行。培养条件包括：培养基pH值发酵温度供氧量等。（5）菌种鉴定经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特征、血清学试验等。现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组分、计算机数值分析。（6）毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。二、菌种的保藏与复壮（一）菌种的保藏1、菌种保藏的意义菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。2、菌种保藏的原理菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：A斜面冰箱保藏法（酵母）斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。B石蜡油封存法（酵母）向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。3、菌种保藏的方法C沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌）这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法是：首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为l－2∶l混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右，121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用80目过筛，土用30－100目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期可达2-10年不等。D真空冷冻干燥保减法（细菌，防线菌）真空冷冻干燥保臧法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度下（－15℃），快速她将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此，菌种可以保存很长时间，一般5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。这种方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。牛奶可以离心或加热的方法脱脂。E液氮超低温保藏法（细菌，真菌）液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保臧法。其保存期最长。a原理用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一130℃），所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。b操作方法及步骤（1）安瓿管要求由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用95料或GCl7的玻璃管，安瓿管选好后印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用。（2）菌种准备及分装因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为10％甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为0.2－1mL。（3）冻结液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。美国ATCC采用先将菌液降温到0℃，再以每分钟降低1℃的速度，一直降低到－38℃，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加。（4）重新培养当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或35－40℃水浴中迅速解冻，当升温至0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。4、国内外主要菌种保藏机构介绍菌种是一个国家的重要资源，世界各国都对菌种极为重视，设置了各种专业性保臧机构，主要的菌种保臧机构介绍如下：（1）ATCCAmericanTypeCultureCollection.Rockvil1．Maryland.U.S.A。美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。（2）CSH〔（ColdSpringHarborLaboratory），U.S.A冷泉港研究室，美国。（3）IAM（InstituteofAppliedMicrobiology），UniversityofTokyo，Japan。日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。（4）IFO（InstituteforFermentation），Osaka，Japan。发酵研究所，日本大阪。（5）KCC（KakenChemicalCompanyLtd），Tokyo，Japan。科研化学有限公司，日本东京。（6）NCTC（NationalCollectionofTypeCu⒒ure），LondonUnitedKingdom，国立标准菌种收藏所，英国伦敦。（7）NIH（NationalInstitutesofHealth），Bethesda，Maryland，U.S.A国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。（8）NRRL（NorthernUtilizationResearchandDevelopmcntDivision，U.S.DpartmentofAgriculture，Peoria，U.S.A。美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。在我国为了推动菌种保臧事业的发展，1970午7月在国家科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作会议，在会上成立了中国微生物菌种保减管理委员会（CCCMS）委托中国科学院负责担负全国菌种保臧管理业务，下设六个菌种保藏管理中心。l）普通微生物菌种保臧管理中心（CCGMC）；中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌，细菌。中国科学院武汉病毒研究所，武汉（AL－IV）：病毒。2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）；中国农业科学院土壤肥料研究所，3）工业微生物菌种保臧管理中心（CICC）；轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。4）医学微生物菌种保臧管理中心（CMCC）；中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID）∶真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）；中圈医学科学院抗生素研究所，北京和四川抗生素工业研究所，成都：新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）；农业部兽医药品监察所，北京。（二）菌种的衰退与复壮1、菌种衰退：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。2、菌种退化的原因：基因突变；变异菌株性状分离；诱变的单菌落是由—个以上孢子或细胞形成菌落由—个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞单核孢子发生突变时，双链DNA上仅—条链上某个位点发生变化连续传代其它因素菌种保藏不当生长条件不满足（培养基组成、培养条件）3、防止菌种退化的措施控制传代次数选择合适的培养条件选择合适的保藏方法菌种稳定性检查分离复壮4、菌种复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。复壮措施：对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化淘汰衰退的个体选择合适的培养基三、菌种选育菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种，从而促进生产发展。目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等