细胞总RNA提取

细胞总RNA的提取一、准备1、物品：Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、75%灭酶异醇、冷PBS、1.5ml灭酶EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管2、打开冷冻离心机4℃预冷二、操作步骤：将Trizol、氯仿、冷PBS、EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管等物品带入细胞室。1、取出EP管、做好标记2、取出细胞、收集上清保存备用3、用冷PBS冲洗细胞两次4、加入1mlTrizol（24孔板每孔加0.5ml即可），调小刻度用移液器吹打细胞至液体澄清（生化：摇动混匀后室温孵育10min）5、将裂解液转移至1.5ml灭酶EP管中，用黄枪头加入氯仿0.2ml（1/5Trizol体积），用手剧烈震摇15秒，置室温5min（生化：3mindxyer：15min），分层6、4℃、12000g（12300rcf）离心15min，可见分层。7、用黄枪头小心收集上层水相约0.5ml置于另一1.5ml灭酶EP管中（确保不要吸入中间层和有机相）。8、各管分别加入0.5ml异丙醇（等体积），用力摇匀，置室温10min。（提前将异丙醇4℃预冷，或混匀后置-20℃60min，提取效果更好）9、4℃、12000g离心10min，可见RNA沉淀。10、倒弃上清，用滤纸吸干管口余液，加入预冷的75%灭酶异醇1ml，用指轻弹管壁使RNA沉淀飘起洗涤。11、4℃、7500g（7700rcf）离心5min，生化为10min，（亦有dxyer用12000g），沉淀即为总RNA。12、弃上清，真空干燥约4min或空气中干燥5~10min，加入20祃（30祃）DEPC水。13、56℃水浴小于10min助溶，取少量测OD值，其余-70℃保存备用。[/sell]