琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳与蛋白质分子相类似，核酸分子也是两性电解质。⑴在pH3.5时，核酸分子带正电荷，在电场中向负极移动；⑵在pH8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。琼脂糖凝胶电泳是采用琼脂糖凝胶作为电泳支持物的一种简单、快速分离纯化和鉴定核酸特别是DNA的方法。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取出来的，为一种聚合链线性分子。琼脂糖凝胶的孔经较大，主要用于分离较大片段的DNA分子（100bp～60kb）。一、电泳基本原理⑶不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。但采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率产生较大的差别，则可达到分离的目的。⑷DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范围内是分子质量的函数，分子质量越大，移动越缓慢。因此，利用琼脂糖凝胶电泳相对于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相对分子质量。琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围胶浓度（％）线性DNA分子大小（kb）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3二、仪器设备及材料1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、胶床和梳子三部分组成。2、稳压电泳仪：电压可变范围0～300～600V，电流可变范围0～250～500mA。3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm3个波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色有机玻璃防护板。4、照相机：5、微波炉：6、其它：三角烧瓶、量筒、胶带纸、一次性手套等。三、主要试剂1、琼脂糖：根据需要用电泳缓冲液配成不同浓度。本实验配制2％Agrose：2gAgrose100ml0.5×TBEEB少许（终浓度0.5μg/ml）2、电泳缓冲液：常用的缓冲液有TBE、TAE和TPE三种。本实验选用TBE，先配制5×TBE贮存液：54gTris碱27.5g硼酸20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)（或4.65gEDTA）加ddH2O至1000ml。用时稀释为0.5×TBE。调pH至8.23、6×上样缓冲液：4℃贮存0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30％甘油水溶液4、10mg/ml溴化乙锭（EB）：贮存液在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时确保其完全溶解，棕色瓶室温保存。溴化乙锭（EB）染色原理：溴化乙锭是一种荧光染料，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。这是因为：①在紫外线照射时，核酸吸收波长为254nm的紫外线并将能量传递给溴化乙锭；②同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收302nm和366nm波长的紫外线，来自两方面的能量最终激发出波长为590nm的红橙色可见荧光。溴化乙锭用于核酸染色的优点：⑴染色操作简单，一般在凝胶中加入终浓度0.5μg/ml的EB即可，在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动。也可在电泳结束后，将凝胶浸泡在EB里30分钟即可。⑵EB染色不会引起核酸的断裂，其它染料做不到这一点。⑶EB染色灵敏度较高，可以检测出10ng的DNA样品。溴化乙锭缺点：EB是一种强诱变剂，并有中度毒性。注意：①操作中务必带上防护用手套。②如不慎皮肤与溶液接触，应立即用清水彻底冲洗。③含溴化乙锭的溶液使用后应进行净化处理，使其致诱变活性下降为原来的1/200左右，方可丢弃。四、电泳操作步骤2、胶床准备：①取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成约5～8mm的挡墙。②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙。③将胶床放在调整好的水平台上。1、凝胶准备：用0.5×TBE配制2％琼脂糖凝胶。①称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml0.5×TBE；②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖；③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB0.5μg/ml，并轻轻混匀。3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度3～5mm。4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。5、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越过凝胶表面1～2mm为宜。6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：电压1～5v/cm；时间1小时左右。10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。11、电泳结果分析：①紫外检测仪直接观察电源条带；②摄影记录；③凝胶成像分析系统处理。五、注意事项：1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。2、用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免灌胶时有胶液漏出。3、用微波炉熔化琼脂糖时，应控制好时间，以免突然产生气泡，使琼脂糖溢出来。4、凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固。5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除。6、上样时，加样器吸头要轻贴样品孔壁，但不要碰坏孔壁，否则电泳条带不整齐。7、电泳前，确认样品孔位于电场负极。8、因EB存在，全部操作过程要带防护手套。含EB的溶液应做净化处理。