PBMC的分离

PBMC的分离物品准备：外周血来源的白细胞浓缩液、生理盐水、50ml注射器×1、20ml注射器×3、10ml注射器×2、50ml离心管×7、15ml离心管×4、淋巴细胞分离液分离步骤：1、将外周血来源的白细胞浓缩液用生理盐水1：1稀释，从离心管边缘轻轻加于淋巴细胞分离液上面（淋巴细胞分离液与外周血来源的白细胞浓缩液等体积），离心（2000r/min，20min，22℃），分离白膜层细胞即外周血单个核细胞（PBMC）。2、用培养液洗涤5-6次（离心速度1500r15min-1500r15min-1000r10min-800r10min-800r5min），用含10%的胎牛血清的RPMI1640液调整细胞浓度为2×106/ml，加入6孔板，于37℃，5%CO2孵育箱培养2h，吸去悬浮的细胞，用温热的RPMI1640培养液洗涤2遍，所得的贴壁细胞即DC前体细胞。3、所吸去的悬浮细胞为淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的RPMI1640（含终浓度为800U/L的rhIL-2）重悬，计数并调整细胞密度为1×106/ml，置于75cm2培养瓶内，37℃，5%CO2孵育箱培养，隔天换含新鲜IL-2的RPMI1640培养液维持细胞活力，待用。注意事项：1、密度梯度离心时，加速度宜慢2、密度梯度离心时间不宜过长，对细胞损伤较大3、如分离后的细胞悬液中有较多红细胞，可使用红细胞裂解液，37℃裂解5min，注意裂解时间不宜过长，以免一项单核细胞活性4、稀释血和分离液的比例可以是1：1或2：1，最好达离心管的1/2-2/3，1/2最好，分层明显，即50ml的离心管只装到30ml5、吸取白膜层时，注意不要吸到分离液，可以先吸去血浆层6、注意淋巴细胞分离液和细胞培养液使用前都应水浴至室温7、离心后离心管中液体分为5层：血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层。8、低速离心有助于去除细胞悬液中的血小板，因此洗涤时离心速度较低